论文摘要
本研究以产蛋后期肉种母鸡和海兰鸡胚为实验模型，采用体内和体外相结合的研究方法，探讨大豆黄酮对鸡肝脏卵黄蛋白原（vitellogenin，VTG）基因表达的影响及机制。1大豆黄酮对产蛋后期母鸡生产性能、蛋品质及肝脏中VTG mRNA表达的影响本实验以换羽后第二次产蛋后期（67周龄）的肉种母鸡（矮脚B）为动物模型，研究大豆黄酮对其产蛋性能与肝脏中VTG mRNA表达的影响。实验选取肉种母鸡480只，随机分为两组：对照组（C）饲喂基础日粮，实验组（Da）在基础日粮中添喂10mg／kg的大豆黄酮，每组设8个重复。实验周期为8周，在整个实验期间采取自由饮水，温控在22±1℃，光照为每天15小时。每天记录各组的产蛋数，在第5周时，收集后三天的种蛋，每组随机抽取30枚种蛋作蛋品质分析。在第6周末，每组随机选取10只母鸡宰杀后采样，收集血清、肝脏、卵巢、卵泡、产道等组织样品进行分析。结果显示：添喂10mg／kg大豆黄酮后的母鸡，前两周产蛋率显著上升（p＜0.05），且整个实验期间一直维持高产蛋率。蛋品质的分析结果表明：两组间种蛋平均重量无显著差异（60.67±0.75g vs 59.56±0.68g）；种蛋的蛋壳厚度（0.32±0.01mm vs 0.35±0.01mm）和蛋壳比重（12.12±0.13％vs 12.57±0.15％）显著增加，与对照组相比，分别增加了0.03mm和0.45％（p＜0.01和p＜0.05）；蛋壳强度有所增加（13.0±0.3kg／cm2 vs 13.4±0.5kg／cm2），但未达到显著性水平（p＞0.05）；大豆黄酮组种蛋的破蛋率显著降低，但两组间畸形蛋比率无显著差异（p＞0.05）；种蛋的Haugh单位（80.98±1.13）显著提高，比对照组种蛋的Haugh单位（76.98±1.33）提高了4.0个单位（p＜0.05）；蛋黄重、蛋清重、蛋黄颜色等指标均无显著性变化（p＞0.05）。添喂大豆黄酮第六周后屠宰母鸡，采样记录结果表明：与对照组相比，大豆黄酮组母鸡的体重、卵巢内大卵泡数、产道重量均无显著性变化（p＞0.05）。此外，采用RT-PCR方法，以β-actin为内标，检测母鸡肝脏中VTG mRNA的表达变化。结果表明：饲喂大豆黄酮6周后，对产蛋母鸡肝脏中VTG mRNA的表达无显著影响（p＞0.05）。2大豆黄酮对肝细胞中VTG mRNA及雌激素受体mRNA表达的影响为了避免体内多种因素的影响，我们进一步采用体外分离培养鸡胚肝实质细胞，采用无血清培养基来探讨大豆黄酮对VTG mRNA表达的影响。从15胚龄的海兰鸡胚中分离得到肝实质细胞，首先采用含5％的胎牛血清培养液预培养肝细胞，为了去除血清因素的影响，预培养24小时后，撤去培养液，采用无血清的ITS培养基(培养液中添加10／μg／mL胰岛素、5μg／mL转铁蛋白和3×10-8mol／L亚硒酸钠)，同时添加大豆黄酮、17β-estradiol（E2）、tamoxifen（TAM），以及在不同的雌激素背景下，添加不同剂量的大豆黄酮和／或tamoxifen，处理48小时后收集细胞提取总RNA。采用RT-PCR方法，以β-actin为内标检测大豆黄酮对肝细胞VTG mRNA及雌激素受体（ERα和ERβ）mRNA表达的影响。结果表明：100μM大豆黄酮在体外无血清培养的条件下，能诱导肝细胞中VTG mRNA的表达；在不同的E2的背景下，大豆黄酮的效应存在差异，在1μM E2的背景下，100μM的大豆黄酮促进肝细胞中VTG mRNA表达，且表现出与雌激素的协同效应；而在此条件下，添加1μM和10μM的大豆黄酮对肝细胞VTG mRNA表达无显著性影响（p＞0.05）；在10μM E2的背景下，大豆黄酮表现出抗雌激素效应，且具有剂量依赖性。当添加10μM的选择性雌激素阻断剂-tamoxifen后，VTG mRNA的表达受到显著性抑制（p＜0.05）。无论培养液中是否添加雌激素，100μM的大豆黄酮对ERαmRNA的表达没有显著的影响，而同时添加10μMTAM可显著上调ERαmRNA的表达，仅10μMTAM也可显著上调ERαmRNA的表达（p＞0.05）。此外，本实验结果表明，大豆黄酮可以显著上调ERβmRNA的表达（P＜0.05），且TAM可以阻断大豆黄酮上调ERβ基因的表达，而当在有雌激素背景下，ERβmRNA的表达显著上调，添加大豆黄酮和／或TAM不能进一步影响ERβmRNA的表达（p＞0.05）。以上实验结果表明：大豆黄酮可以显著提高产蛋后期母鸡的产蛋性能，提高蛋壳厚度和蛋的新鲜度。在低雌激素背景下，一定剂量的大豆黄酮能促进VTG mRNA的表达；而在高雌激素背景下，大豆黄酮对VTG mRNA的表达具有拮抗效应，且大豆黄酮可能通过ERβ调节VTG基因的表达。