日本脑炎病毒多表位基因与法氏囊活性肽的串联表达及其免疫特性研究

论文摘要

日本脑炎（Japanese Encephalitis, JE）,又称流行性乙型脑炎（Epidemic Encephalitis B）,是由日本脑炎病毒（Japanese Encephalitis Virus, JEV）引起的以中枢神经系统损害为主的急性传染病。猪作为日本脑炎传播的中间扩增宿主,带毒蚊子通过叮咬将感染性病毒传播给人。该病在我国流行面积较大,对养猪业的危害巨大,近年来经济损失较为严重,因此预防猪感染本病是防止人患乙脑的重要措施。目前对乙型脑炎的治疗仍然没有行之有效的方法,而且对待本病主要还是以免疫接种疫苗的方式进行预防。寻求稳定、安全的猪用乙脑疫苗,已经成为近年JEV感染防治的主要研究方向。目前关于表位疫苗的设计策略取得了较大的研究进展,作为理想的免疫原,抗原分子中应同时包含目的抗原B细胞表位和自身或外源T细胞表位,才能诱导出高特异性的细胞及体液免疫应答,从细胞免疫和体液免疫水平起到预防或治疗作用,赋予较广泛的保护性。因此表位疫苗成为近年来病毒新型疫苗研究的热点。法氏囊（bursa of Fabricus, BF）是禽类独有的中枢免疫器官,其功能与哺乳动物中的骨髓类似。三肽囊素作为BF组织中分离的活性分子,无种属特异性,不仅对禽类具有免疫调节功能,而且对哺乳动物及人类淋巴细胞也具有明显的免疫学及生理学活性。法氏囊五肽为BF组织中分离的又一活性分子,对禽类具有明显的免疫调节功能。本研究利用基因重组技术,把日本脑炎病毒E蛋白上的多表位基因（MEP）、囊素样肽基因和法氏囊五肽基因分别串联起来,构建三种原核表达载体,在大肠杆菌表达系统中表达。表达的融合蛋白纯化后免疫小鼠,研究三者的免疫原性及保护效力,希望为研制具有高免疫原性的改良的乙脑表位疫苗提供依据。具体的研究内容如下：1串联表达JEV E蛋白多表位基因、囊素样肽及法氏囊五肽利用PCR扩增出含日本脑炎病毒（JEV）E蛋白6个B细胞表位（氨基酸残基分别位于75-92,149-163,258-285,356-362,373-399,397-403）,2个T细胞表位的基因（氨基酸残基分别位于60-68和436-445）,即JEV E蛋白多表位基因（MEP）,用EcoRl和Xhol双酶切将其连接到pET-28a（+）载体中,构建含MEP基因的重组原核表达载体。由于囊素样肽（Bur sin-like peptide, BSA）能增强乙脑亚单位疫苗的免疫反应,在本研究中还构建了一个在大肠杆菌中表达的重组载体,将JEV E蛋白多表位基因（MEP）按正确的读码框与囊素样肽基因串联,构建含MEP-BSA基因的重组原核表达载体。此外,法氏囊五肽（Bursopentine, BP5）为本组从鸡法氏囊中新分离的一种活性肽,为了弄清其免疫佐剂效应,本研究将JEV E蛋白多表位基因（MEP）、囊素样肽基因按正确的读码框与法氏囊五肽基因串联,构建另一个融合表达载体pET-MEP-BSA-BP5。将三种重组表达载体在大肠杆菌BL21中诱导表达,以His-Bind螯合层析柱纯化三种融合蛋白（rMEP、rMEP-BSA、rMEP-BSA-BP5）,然后运用SDS-PAGE进行可溶性分析,利用Western Blotting对该融合蛋白进行了鉴定。结果表明：三种融合蛋白均以包涵体的形式获得了高效表达。通过His-Bind螯合层析柱纯化后的三种融合蛋白,通过Western Blotting鉴定其具有良好的抗原性。2重组蛋白rMEP、rMEP-BSA、rMEP-BSA-BP5对小鼠特异性免疫的影响4-6周龄雌性BALB/c小鼠随机分成5组,每组10只。将50μg的rMEP、 rMEP-BSA、rMEP-BSA-BP5三种融合蛋白（用100μl PBS稀释）分别以肌肉注射接种的方式给小鼠进行3次免疫,同时设两组对照组小鼠,分别是PBS和JEV弱毒疫苗（SA-14-14-2病毒株）。通过检测中和抗体、抗体亚型（IgG1和IgG2a）、淋巴细胞增殖、INF-y和IL-4细胞因子的表达水平、T细胞亚型、攻毒实验发现,使用rMEP、 rMEP-BSA、rMEP-BSA-BP5三种融合蛋白都能明显的提高小鼠的特异性免疫反应。IgG1和细胞因子IL-4水平表明rMEP蛋白主要刺激Th2型免疫反应。而rMEP-BSA和rMEP-BSA-BP5蛋白既能刺激Th2型免疫反应,也能刺激Thl型免疫反应。然而,Thl型免疫反应明显低于JEV弱毒疫苗但高于rMep蛋白,rMEP-BSA和rMEP-BSA-BP5两个蛋白产生的免疫反应很相似。攻毒实验结果表明]MEP、 rMEP-BSA、rMEP-BSA-BP5与弱毒苗一样都能保护小鼠免受致死量的乙脑病毒的感染,且保护率均为100%,证明rMEP、rMEP-BSA、rMEP-BSA-BP5三种融合蛋白具有较好的免疫原性,这为下一步猪体免疫试验奠定了基础。由此也可以看出囊素样肽联合多表位抗原可以提高小鼠的免疫反应,而法氏囊五肽的增强作用不是很明显。因此rMEP、rMEP-BSA可以作为候选的基因工程亚单位疫苗。

论文目录

• 目录
• 摘要
• ABSTRACT
• 英文缩写及名称
• 第一篇 文献综述
• 第一章 流行性乙型脑炎的研究进展
• 1 流行性乙型脑炎病毒的分子生物学特性
• 1.1 流行性乙型脑炎病毒的病原学特性
• 1.2 流行性乙型脑炎病毒基因组的结构特征
• 2 流行性乙型脑炎的流行
• 3 流行性乙型脑炎病毒的分类和分型
• 4 流行性乙型脑炎病毒的毒力和致病机理
• 5 流行性乙型脑炎病毒的检测方法
• 5.1 流行性乙型脑炎病毒的培养鉴定
• 5.2 流行性乙型脑炎病毒的血清学检测
• 5.3 流行性乙型脑炎病毒的分子生物学检测
• 6 流行性乙型脑炎病毒疫苗的研究概况
• 6.1 传统的鼠源灭活疫苗
• 6.2 减毒活疫苗
• 6.3 基因工程亚单位疫苗
• 6.4 合成肽疫苗
• 6.5 核酸疫苗
• 6.6 基因工程重组活载体疫苗
• 参考文献
• 第二章 法氏囊活性小肽的研究进展
• 1 法氏囊及其生物学功能
• 2 法氏囊免疫活性物质研究
• 3 法氏囊活性肽的研究进展
• 3.1 囊素三肽的研究进展
• 3.2 法氏囊五肽的研究进展
• 3.3 法氏囊七肽的研究进展
• 3.4 其它法氏囊活性肽的研究
• 4 法氏囊活性肽的应用前景
• 参考文献
• 第三章 多表位病毒疫苗的研究进展及应用
• 1 病毒抗原表位的确定方法
• 1.1 单克隆抗体技术
• 1.2 噬菌体展示技术
• 1.3 多肽合成技术
• 1.4 SDS-PAGE和Western blotting技术
• 1.5 人工预测技术
• 2 多表位病毒疫苗
• 2.1 B细胞多表位疫苗
• 2.2 Th细胞多表位疫苗
• 2.3 细胞毒性T淋巴细胞（CTL）多表位疫苗
• 3 多表位病毒疫苗在疫苗研究、开发领域中的应用
• 4 展望
• 参考文献
• 第二篇 研究内容
• 第四章 串联表达JEV E蛋白多表位基因、囊素样肽及法氏囊五肽
• 摘要
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 目的基因的扩增
• 2.2 重组表达载体的构建及双酶切鉴定
• 2.3 重组蛋白（rMEP、rMEP-BSA、rMEP-BSA-BP5）的表达
• 2.4 表达产物的纯化
• 2.5 重组蛋白的可溶性分析及Westem—blot分析
• 3 讨论
• 参考文献
• Abstract
• 第五章 重组蛋rMEP、rMEP-BSA、rMEP-BSA-BP5对小鼠特异性免疫的影响
• 摘要
• 1 材料与方法
• 1.1 材料及试验动物
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 JEV病毒抗体和抗体亚型检测
• 2.2 血清中IL-4和IFN-γ的测定
• 2.3 JEV中和抗体的产生及对致死量JEV的保护力
• 2.4 MTT分析
• 2.5 脾T细胞亚群分析
• 3 讨论
• 参考文献
• Abstract
• 全文总结
• 致谢