论文摘要
某些肿瘤导致A、B血型物质减少的现象日益引起关注,已有研究报道多种恶性肿瘤中血型抗原的异常表达状态与肿瘤的恶性程度、转移和预后等恶性生物学行为有关。白血病患者的红细胞表面A/B血型表达量下降,近年来一直有个案的报道,但缺乏大样本量的调查和规律总结以及相关研究。本研究通过检测血液病患者和健康人红细胞表面ABH血型抗原量的变化并分析其变化规律,探讨血型抗原改变与血液病间的相关性;通过基因分型血液病患者和健康人分为ABO血型纯合子和杂合子组后,采用流式细胞术和激光共聚焦显微镜检测各组样本红细胞表面ABH抗原量,结果显示白血病患者A/B血型抗原表达普遍下降,下降的顺序为AML>CML>ALL;所有的样本的H抗原没有改变,说明白血病患者的A/B抗原改变的原因是由于A/B抗原的合成减少而非H抗原减少所致;统计学分析也显示A抗原和B抗原在恶性血液病中表达量的减弱顺序为AML>CML>ALL,但在各型恶性血液病中A抗原和B抗原减弱程度之间两者无显著性差异（P>0.05）。为进一步探讨白血病患者红细胞ABO血型抗原量下降的原因,本研究采用RT-PCR技术检测健康人和白血病患者ABO基因的表达;通过对比白细胞患者ABO血型基因mRNA的表达量显示,罹患AML的患者,ABO基因mRNA的表达量最低,CML患者次之,ALL的ABO基因mRNA表达量最接近健康人;统计学分析显示,罹患白血病的不同ABO血型的患者,其ABO基因mRNA表达没有差异,即各血型组间无统计学差异（P<0.001）。RT-PCR的检查结果与A/B抗原的减弱规律相吻合,推测白血病患者A/B抗原的表达下降与ABO糖基转移酶基因表达下调有关。ABO糖基转移酶基因表达与基因的表达调控有关,基因的启动子作为RNA聚合酶的结合部位,是转录起始的部位,在基因表达的调控中,转录的起始是个关键,对基因的表达以及蛋白质的合成至关重要。本研究开展对ABO血型基因启动子的研究,以期探讨恶性血液病患者A/B血型抗原表达下降与启动子改变（包括基因突变和甲基化修饰）的相关性,以及启动子甲基化位点的规律性。在扩增出所有样本的启动子序列,测序后进行比对发现,所有样本的启动子序列一致,说明ABO基因启动子高度保守。用重亚硫酸盐修饰DNA后,扩增出所有样本的ABO基因启动子序列并进行测序,比对后发现白血病患者的ABO血型基因启动子区有甲基化的现象,而作为对照的健康人则没有甲基化的现象,提示启动子区CpG岛的甲基化有可能是造成ABO血型抗原表达下降的原因;测序结果显示,甲基化位点大多集中在位置为-102、-101、-100、-99和-97位置的C碱基上,提示这些位点C碱基的甲基化是白血病的特征之一,有可能成为白血病早期诊断的分子标识物。把甲基化修饰后的扩增产物连接到载体上,转染到大肠杆菌内,培养后挑取克隆测序,结果显示白血病患者甲基化位点呈现多态性,出现多个甲基化位点。在针对-102位点的甲基化特异性PCR（MSP-PCR）试验结果显示,健康人、再生障碍性贫血（AA）患者和白血病患者的基因均能用U引物扩增出163bp的产物,白血病患者样本用M引物能扩出的163bp产物,而健康人的样本用M引物不能扩增出产物,通过检测-102位点是否甲基化可以将健康人和白血病患者区分开来,提示-102位点是否甲基化可作为白血病鉴别诊断中一个有意义的分子标识物。近年来,造血干细胞移植在治疗白血病的医疗手段中应用越来越广,移植中要求主要组织相容性抗原相合而并不要求ABO血型要一定相合,但ABO血型同样与排斥反应密切相关。评价造血干细胞移植效果的试验主要有血常规的检测和STR试验,但都有局限性,不能很好地评价造血干细胞的移植效果。为找到更好的实时观测指标,在对ABO血型与恶性血液病的相关性研究的基础上,本研究探讨检测ABO基因启动子甲基化和mRNA表达用于评价造血干细胞移植效果的可能性。通过追踪4例进行了造血干细胞移植的白血病患者,检测ABO血型启动子区-102位点是否甲基化以及mRNA的变化来观察造血干细胞移植效果;采用MSP-PCR试验未发现有ABO基因启动子区甲基化的现象,即未发现异常分化的细胞（白血病细胞）,说明4例患者移植后白血病均未复发;而检测移植后40天内白血病患者ABO基因的mRNA发现,移植后患者ABO基因的mRNA是一个变化的过程,随着病情的转归而出现了变化的表达量,试验结果与患者的临床症状相一致,因此检测ABO基因mRNA表达水平可能具有动态实时评价移植效果的价值。需要说明的是,由于病例有限,我们所发现的目前还只是一个现象,要提出有说服力的证据仍然需要更深入的研究。本研究检测总结了白血病患者的ABO血型抗原和基因的表达规律,发现了导致ABO基因的表达下降因素是由于白血病患者ABO基因启动子区的甲基化,并发现了可能具有诊断价值的特异性的甲基化位点;从蛋白抗原到RNA再到DNA等方面检测了白血病患者ABO基因的表达机理。并在此研究基础上,提出采用MSP-PCR方法和检测ABO基因的表达来用于评价白血病患者造血干细胞的移植效果,试验结果显示这种方法具有实用价值,并且未见有国内外的文献报道。ABO血型否与白血病的进程和预后有关,还有待进一步的研究。我们将在此基础上继续开展对红细胞ABO血型抗原和基因表达的研究,以期在白血病的诊断、进程和预后的判断上发现具有临床应用价值的分子标识物。