油茶亲环素、钙调素基因的cDNA克隆及亲环素基因的原核表达

论文摘要

油茶是我国重要的木本食用油料树种,栽培面积大,分布广,适应性。茶油中富含油酸、亚油酸等不饱和脂肪酸,是一种优质食用植物油,其副产品也有重要用途。亲环素基因是多基因家族,包括亲环素A、亲环素B、亲环素C、亲环素D等多种类型,广泛分布于几乎所有生命体中。它具有肽脯氨酰顺反异构酶活性,充当伴侣分子,是蛋白质折叠的限速酶。在蛋白质折叠、输送、细胞的形成、生长、成熟、凋亡、mRNA加工、信号传导、人类Ⅰ型免疫缺陷病毒的感染以及复制等多种生理活动中发挥重要作用。植物亲环素基因还在逆境胁迫应激反应中发挥重要作用。本研究以中南林业科技大学经济林育种与栽培重点实验室构建的油茶cDNA文库和EST文库为材料,分离克隆了油茶亲环素基因、钙调素基因,构建油茶亲环素基因的原核表达载体并表达得到油茶亲环素蛋白。主要研究结果如下：1.首次成功地分离鉴定了油茶种子亲环素基因的cDNA序列。该cDNA全长975bp,包含一个621bp的编码区及5’端非编码区和带Poly（A）的3’端非编码区,编码区共有207个氨基酸。该蛋白具有26个氨基酸的信号肽序列,14个氨基酸的卷曲螺旋结构和2个N-连接糖基化位点等结构域；该蛋白整体结构为多β-折叠结构,为球状蛋白。氨基酸比对和同源性分析表明：油茶亲环素基因与人类、拟南芥、茶叶的亲环素基因具有高度的相似性和同源性。其中,它与茶叶亲环素基因的氨基酸序列同源性高达94%,该基因含有植物亲环素基因特有的7个氨基酸序列（KSGKPLH）。该基因可能参与油茶生长、发育、信号传导、胁迫应答以及免疫抑制等生理过程。2.首次成功地分离鉴定了两个油茶种子的钙调素基因cDNA序列（CaM1和CaM2）。它们的长度分别为953bp和1024bp,均含有一个450bp的ORF,并编码完全相同的149个氨基酸。油茶钙调蛋白的这种特性符合“多个基因---一种蛋白”假设。这两个油茶钙调素基因的核苷酸序列在编码区具有高度一致性,只有20个碱基替代。油茶钙调蛋白的氨基酸序列与其他植物钙调蛋白的氨酸序列同源性很高,一致性高达90%以上。油茶钙调蛋白由19种氨基酸组成,理论等电点4.10,为亲水性蛋白。该蛋白不含信号肽,没有跨膜结构,包括4个EF-手臂、钙离子结合位点、半胱氨酸（Cys-27）以及一个未知功能区等结构域。该基因可能参与油茶的细胞生长和发育、信号传导、调控离子通道、膜蛋白、细胞分裂、受精、分泌、细胞增殖、凋亡、抗病抗逆等生理过程。3.成功地构建了油茶亲环素基因原核表达载体,并得到了油茶亲环蛋白。该蛋白属于亲环素B,分子量为22.244 kDa,与预期亲环蛋白的分子量大小完全一致。本实验获得的油茶亲环蛋白可以进一步为测试肽基脯氨酰顺反异构酶活性、确定IC50与结合环孢菌系数以及为深入探讨油茶亲环素基因结构与功能的关系奠定基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 绪论
• 1.1 油茶概况及相关研究进展
• 1.1.1 概况
• 1.1.2 油茶的相关研究
• 1.2 亲环素基因
• 1.2.1 植物亲环素基因的结构特点
• 1.2.2 植物亲环素的功能
• 1.2.3.植物亲环素基因的表达调控
• 1.2.4 Cyp基因的原核表达
• 1.3 钙调素
• 1.3.1 钙调素的分布
• 1.3.2 CaM的结构与性质
• 1.3.3 植物CaM的表达及其所受影响因素
• 1.3.4 钙调素的功能
• 1.3.5 钙调素基因的克隆cDNA及相应氨基酸同源性分析
• 1.3.6 表达质粒的构建及表达
• 1.4 亲环素基因和钙调素基因的关系
• 1.5 本课题研究的目的和意义
• 1.6 油茶亲环素和钙调素基因研究的技术路线
• 2 油茶亲环素基因的cDNA隆与结构分析
• 2.1 材料与试剂
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 仪器设备
• 2.1.3 试剂与溶液
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 菌液的活化、培养大肠杆菌的活化和培养
• 2.2.2 质粒的小量提取
• 2.2.3 CyP基因克隆的鉴定
• 2.2.4 油茶CyP基因CDS的获得
• 2.2.5 油茶CyP基因的结构特征分析
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 pBlue-CoCyP质粒DNA提取和检测
• 2.3.2 目的克隆的PCR扩增及双向测序结果
• 2.3.3 CyP基因的鉴定
• 2.3.4 CyP基因全长cDNA克隆及序列特征分析
• 2.3.5 油茶CyP基因与其他物种CyP基因比较
• 2.3.6 油茶CyP的结构分析
• 2.4 讨论
• 3 油茶钙调素基因的cDNA克隆
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 方法
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 pBlue-CaM质粒DNA提取
• 3.2.2 目的克隆的PCR扩增
• 3.2.3 油茶钙调素CaM1和CaM2基因的鉴定
• 3.2.4 油茶钙调素基因CaM1和CaM2的cDNA克隆及序列特征分析
• 3.2.5 油茶钙调素与同源植物钙调素的同源性比较
• 3.2.6 蛋白质结构分析
• 3.3. 讨论
• 4 亲环素基因的表达载体的构建及原核表达
• 4.1 材料与试剂
• 4.1.1 菌株和质粒
• 4.1.2 试剂与药品
• 4.1.3 溶液及培养基
• 4.1.4 主要仪器设备
• 4.2 方法
• 4.2.1 表达载体的构建
• 4.2.2 亲环素蛋白的诱导表达
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 表达载体的构建及鉴定
• 4.3.2 亲环素基因CyP的原核表达
• 4.3.3 亲环素基因的大量表达
• 4.4 讨论
• 5 结论与创新
• 5.1 结论
• 5.2 创新点
• 参考文献
• 附录
• 附录A 亲环素基因测序图
• 附录B 油茶亲环素构建表达载体PET30A-CoCYP测序结果
• 附录C 油茶钙调素（0451）测序图
• 附录D 攻读学位期间的主要学术成果
• 致谢