论文摘要
背景动脉粥样硬化是很多心血管疾病,脑血管疾病和外周血管疾病的主要发病原因。动脉粥样硬化除了引起血管狭窄外,还能导致斑块破裂,血栓形成,从而堵塞血管,造成严重的不良心脑血管事件,包括心肌梗死、脑梗死、猝死等。动脉粥样硬化形成的原因非常复杂。血脂异常、内皮功能障碍、炎症细胞浸润、氧化应激、细胞凋亡、脂质沉积、血管生成、胶原代谢等因素均在动脉粥样硬化中发挥了一定的作用。在动脉粥样硬化的早期阶段,内皮功能障碍发挥了主要的作用。所以,维持内皮的正常功能对于预防动脉粥样硬化意义重大。多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶-1（poly（ADP-ribose） polymerase-1, PARP-1）是PARP家族最主要的亚型,发挥了PARP活性的90%。PARP-1能够以NAD+为底物通过催化ADP核糖单位结合到目的蛋白或者PARP本身进行修饰。PARP-1在氧化应激、亚硝酸盐等损伤DNA时,能够识别DNA损伤,被激活。DNA损伤严重时,PARP过度激活,能够引起细胞能量耗竭甚至死亡。越来越多的研究发现,PARP-1激活广泛参与了动脉粥样硬化、心肌梗死、心力衰竭等各种心血管疾病的发生和发展。抑制PARP的激活,能够有效延缓动脉粥样硬化的发生,增加动脉粥样硬化斑块的稳定性。目前研究认为抑制PARP激活主要通过以下机制减缓了动脉粥样硬化的发生发展：一是抑制炎症因子的表达和巨噬细胞的浸润,PARP-1能够与核转录因子kappa B （nuclear factor kappa B, NFκB）结合,促进NFκB的激活,抑制PARP-1能够有效减少血管细胞粘附分子-1（vascular cell adhesionmolecule-1,VC AM-1）、单核细胞趋化蛋白-1（monocyte chemotactic protein-1, MCP-1）、E-选择素（E-selectin）、P-选择素（P-selectin）等炎症因子的表达,并且通过抑制炎症因子的表达,降低单核细胞的趋化性,减少了斑块内巨噬细胞的含量：二是通过增加金属蛋白酶组织抑制剂-3（tissue inhibitor of metalloproteinase-3, TIMP-3）的表达,减少了胶原的代谢；三是通过减少内皮细胞和巨噬细胞凋亡,维持了内皮的完整性,减轻了坏死核心的形成；四是减少活性氧（reactive oxygen species, ROS）和活性氮（reactive nitrogen species, RNS）的产生,减少了氧化应激和硝基化产物的产生；五是维持了内皮的正常功能。一氧化氮（nitric oxide, NO）在内皮功能中起了关键性的作用,它能够调节血管的张力和局部血流,抑制、平滑肌细胞的增殖,调控白细胞和内皮之间的相互作用,并在血栓形成中发挥了一定的作用。作为重要的血管保护分子,NO能够有效抑制动脉粥样硬化的形成和发展。NO在血管系统主要由内皮型NO合酶（endothelial nitric oxide synthase, eNOS）和诱导型NO合酶（inducible nitric oxide synthase, iNOS）产生。尽管已有研究探讨了PARP对eNOS、iNOS的作用,但PARP和NO生成的关系仍未明确。脂质过氧化在动脉粥样硬化的发生和发展过程中具有重要的作用。脂质过氧化过程中,产生的毒性醛类代谢产物,可以与核酸／蛋白结合形成各种加合物,进而导致DNA损伤／缺失／突变以及蛋白质失活,造成DNA和蛋白质的功能异常,甚至可以直接损伤细胞和组织,另外某些毒性醛类可以诱发和加重氧化应激,这些都促进了动脉粥样硬化的发生和发展。醛脱氢酶类能够将毒性醛类代谢成低毒性的羧化物,从而减少脂质过氧化引起的细胞和组织的损伤。在各种醛脱氢酶类中,乙醛脱氢酶2（aldehyde dehydrogenase2, ALDH2）在代谢毒性醛类物质过程中发挥了主要的作用。PARP能否通过调控ALDH2的活性影响动脉粥样硬化的发展,目前尚缺乏这方面的研究。研究目标1.通过PARP抑制剂和敲基因小鼠的方法,进一步明确PARP-1对动脉粥样硬化的影响；2.抑制PARP激活后,观察主动脉NO表达的变化;3.寻找PARP调控NO表达的分子机制。4.探讨PARP对ALDH2表达和活性的作用及可能的机制研究方法1.敲基因小鼠的产生PARP-1-/-小鼠购买自美国Jackson实验室,为用于动脉粥样硬化的研究,将该小鼠与C57BL／6J小鼠杂交至少7代。然后,将得到的C57BL/6J基因基础的PARP-1-/-小鼠与apOE-/-杂交获得实验用的apoE-/-和apoE-/-PARP-1-/-小鼠。2.动脉粥样硬化模型选择6-8周apOE-/-小鼠或者apOE-/-PARP-1-/-小鼠分为apoE-/-小鼠+正常饮食组（control组）、apoE-/-小鼠+高胆固醇组（HD组）、apOE-/-小鼠+高胆固醇+DPQ组（HD+DPQ组）和apOE-/-PARP-1-/-小鼠+高胆固醇饮食组高胆固醇饮食（HD+DKO组）,12周后发生自发性动脉粥样硬化。3.组织学染色高胆固醇饮食12周后,麻醉小鼠,采血后,取小鼠心脏和主动脉,将胸腹主动脉剥去外膜后,进行油红O染色；对主动脉根部进行冰冻切片后,行油红O染色。用Image Pro-Plus软件对胸腹主动脉和主动脉根部斑块面积进行测量。4.免疫组化染色对主动脉根部动脉粥样硬化斑块切片后,进行PARP激活产物多聚腺苷二磷酸核糖（poly ADP ribose,PAR）,DNA氧化损伤产物8-羟基-鸟嘌呤脱氧核苷酸（8-oxo-dG）和3-硝基酪氨酸（3-nitrotyrosine,3-NT）的组织化学染色。5.NO含量的测量总一氧化氮含量采用经典Griess reagent检测亚硝酸盐,从而测定出总一氧化氮。6.蛋白质印迹目的蛋白的表达,采用western blotting的方法进行检测,利用β-actin作为内参对目的蛋白进行定量。7.精氨酸酶活性检测裂解液裂解主动脉或者细胞,提取蛋白,加入左旋精氨酸（L-arginine）后,孵育37℃,60分钟。酶活性表示为纳摩尔尿素每毫克蛋白每分钟（nmol urea/mg protein/min）。8.小鼠腹腔巨噬细胞的分离培养取6到8周的小鼠,腹腔注射2ml的4%的巯基乙酸（thioglycollate）,3天后,打开腹腔,将巨噬细胞分离岀来后,铺六孔板,用于后续实验。9.小鼠内皮细胞的分离培养麻醉小鼠后,打开胸腔,采用心脏灌注的方法,将血液排岀,取胸主动脉,剥除外膜及结缔脂肪组织,剖开,铺在胶原包被的六孔板上,待内皮细胞爬岀后,消化培养内皮细胞。10.人动脉内皮细胞（human aortic endothelial cells, HAECs）的培养及实验在37℃,5%CO2孵箱中,用ECM培养基培养主动脉内皮细胞,根据实验需要进行传代铺板。结果1. PARP抑制剂或者PARP-1基因敲除有效延缓了动脉粥样硬化的形成：通过人体油红O染色或者分析主动脉根部斑块的面积发现,与普通高胆固醇饮食的小鼠对比,抑制PARP激活能够有效减少动脉粥样硬化的生成。2. PARP抑制剂或者PARP-1基因敲除对血象、血脂水平无明业影响。3. PARP抑制剂或者PARP-1基因敲除减少了主动脉斑块内的氧化应激和销酸化产物的生成：通过免疫组化分析斑块内氧化应激产物8-oxo-dG和硝基化产物3-硝基酪氨酸的表达发现,抑制PARP激活能够有效减轻动脉粥样硬化斑块内氧化应激和硝基化产物的产生。4. PARP抑制剂或者PARP-1基因敲除增加了主动脉NO的含量：PARP抑制剂或者PARP-1基因敲除增加了主动脉内NO的生成。通过分析与NO生成相关的蛋白发现,抑制PARP激活减少了精氨酸酶Ⅱ的表达及精氨酸酶的活性,同时发现抑制PARP激活虽然减少了iNOS的表达但是增加了eNOS的磷酸化水平。5. PARP-1基因敲除只影响了精氨酸酶Ⅱ的表达,对精氨酸酶Ⅰ没有明显的影响：在氧化低密度脂蛋白刺激下,发现PARP-1基因敲岀能阻止小鼠腹腔巨噬细胞内精氨酸酶Ⅱ的增加,但精氨酸酶Ⅰ的表达没有明显改变。6. PARP-1基因敲除增加了小鼠内皮细胞NO的生成。7.抑制PARP激活增强了HAECs中ALDH2的活性:Ox-LDL刺激HAECs,能够抑制ALDH2的活性,并呈时间和浓度依赖性,但没有改变ALDH2的蛋白表达。PARP抑制剂能够部分阻止ox-LDL引起的ALDH2活性的抑制。结论PARP抑制剂或PARP-1基因敲除有效延缓了动脉粥样硬化的形成。抑制PARP活性能够减少Arg Ⅱ的表达,增加eNOS的磷酸化水平,从而增加了NO的表达,维持了内皮的正常功能；另外,抑制PARP活性能够阻止ox-LDL引起的ALDH2活性下降。背景白细胞在血管内皮上的滚动、粘附和侵润是动脉粥样硬化形成的关键因素。动脉粥样硬化最初是由内皮功能障碍或内皮损伤开始的,内皮在TNFα、LPS、血脂异常或机械性损伤刺激后,表达P选择素糖蛋白配体1（PSGL-1）、VCAM-1等炎症粘附分子或暴露内皮胶原,引起血液中白细胞、血小板等在内皮表面上滚动和粘附,白细胞粘附在血管内皮后,在PECAM-1、ICAM-1等分子作用下,侵润至内皮下,并在各种炎症因子作用下逐渐变为巨噬细胞,吞噬脂质、死细胞等,形成血管局部的病灶,促进动脉粥样硬化的发生和发展。血小板是来源于骨髓巨核细胞的细胞碎片,有完整的细胞膜,但没有细胞核。血小板的主要功能是介导凝血、止血和修复损伤血管。近几年发现血小板除了上述功能外,还在动脉粥样硬化、炎症、免疫和肿瘤转移等疾病中发挥非常重要的作用。血小板可以在激活物如ADP、凝血酶、血栓烷A2、胶原等作用下发生激活、释放、聚集和粘附等改变。血小板能够参与白细胞在血管内皮表面上的滚动和粘附进而影响动脉粥样硬化的发展。血小板介导白细胞的滚动和粘附,主要有两个方面的机制：一是血小板首先通过血小板膜上的GPⅠbα、GPⅥ、α2β31、αⅡbβ3、 JAM-A、AM-C和CX3CR1等分子与内皮细胞表面的vWF因子或者内皮下胶原的结合,粘附在血管的内皮的表面,然后血小板再通过膜表面上的P-选择素与白细胞表面的PSGL-1相互作用,激活白细胞上Mac-1分子,最后血小板膜上的GPIbα分子与白细胞表面上的Mac-1分子结合,使白细胞紧密的粘附在血管内皮表面上；二是“蹭灰”机制,激活的血小板能够与白细胞相互作用,将血小板表面上的P-选择素、CCL5等分子通过血小板膜与白细胞膜融合的方式转移到白细胞上,进而增强白细胞的粘附功能。核转录因子kappa B （nuclear factor kappa B, NF-κB）是炎症、免疫、凋亡和细胞增值等的关键调控分子,参与了包括炎症因子在内的超过150种基因的表达。正常情况下,NF-κB与它的抑制蛋白IκBα结合在一起,并不能发挥转录活性,当IκBα在IκB激酶（IκB kinase, IKK）作用下发生磷酸化降解后,NF-κB被释放并发生核转位与细胞核内相关基因的转录位点结合,NF-κB才能发挥其转录因子的作用。IKK有多个亚型,包括α、β、γ和新发现的ε四个亚型.其中,IKKβ在磷酸化IκBα过程中发挥着主要作用。利用IKKβ的条件性敲基因小鼠,发现不同细胞中的NF-κB激活情况在动脉粥样硬化中发挥了不同的作用。内皮细胞的IKKβ敲除后能够减轻动脉粥样硬化的发生,而单核细胞里面的IKKβ敲除后却促进了动脉粥样硬化的发展。近几年发现,除了有核细胞具有NF-κB系统外,血小板也含有功能性的NF-κB系统。以往的研究表明,激活的血小板能够促进动脉粥样硬化的发展和损伤血管的内膜增厚。但是血小板中的NF-κB被抑制后对动脉粥样硬化有什么影响还缺乏相关方面研究。因此,本课题主要围绕着血小板中的NF-κB在血小板激活、释放和聚集中的作用以及通过条件性基因敲除的方法抑制血小板中的NF-κB后对动脉粥样硬化和血管内膜增厚的影响进行。研究目标1.运用loxp-Cre系统,构建血小板特异性IKKβ敲基因小鼠;2.西方饮食饲养小鼠12周,观察血小板IKKβ基因敲除事对自发性动脉粥样硬化的影响；3.通过导丝损伤颈动脉内皮,观察血小板IKKβ基因敲除后对新生内膜增厚的影响：4.探讨IKKβ基因敲除后对血小板功能的影响及机制。研究方法1.血小板IKKβ特异性基因敲除小鼠的产生运用loxp-Cre系统构建血小板IKKβ特异性基因敲除小鼠。对PF4-Cre小鼠和floxed的IKKβ小鼠进行杂交产生IKKβfl/fl/PF4cre小鼠,IKKβfl/fl/PF4cre小鼠即为血小板IKKβ基因敲除的小鼠。2.建立动脉粥样硬化模型IKKβfl/fl/PF4cre小鼠与Ldlr-/-小鼠杂交产生Ldlr-/-IKKβfl/fl/PF4cre及对照Ldlr-/-IKKβfl/fl小鼠,给予西方饮食12周,对比自发性动脉粥样硬化的大小。3.新生内膜增厚动物模型的建立首先,西方饮食饲养Ldlr-/-IKKβfl/fl/PF4cre及对照Ldlr-/-IKKβfl/fl小鼠2周,在解剖镜下,从颈外动脉切口,利用导丝损伤小鼠的左颈总动脉5次,结扎颈外动脉,继续喂养小鼠西方饮食4周,对颈总动脉的内膜增厚进行测量。4.血脂及血象分析血浆甘油三酯含量,低密度脂蛋白,高密度脂蛋白和总胆固醇用自动酶标生化仪检测,血液中的白细胞、血小板等血细胞含量用Hemavet仪器检测。5.骨髓移植Ldlr-/-小鼠在致死剂量的射线照射后,采用尾静脉注射法注射其他小鼠来源的骨髓细胞,包括IKKβfl/fl/PF4cre及对照Ldlr-/-IKKβfl/fl小鼠。让骨髓移植的小鼠恢复4周后,进行颈动脉损伤引起的内膜增厚实验。6.中性粒细胞耗竭对新生内膜增厚影响实验为了探讨中心粒细胞在内膜增厚中的作用,通过腹腔注射抗PMN抗体,耗竭血液循环中的中性粒细胞,进而判断中心粒细胞在血小板IKKβ在影响新生内膜增厚中的作用。7. Movat染色利用Movat染色技术对血管内膜和外膜的厚度进行测量。8.免疫组化染色选择抗F4/80抗体,对颈动脉斑块内的巨噬细胞的含量进行统计学分析。9.白细胞在损伤血管内皮表面的粘附实验损伤颈动脉后,对在损伤血管表面上滚动和粘附的白细胞数在活体荧光显微镜下进行观察计算。10.白细胞在激活的血小板上的粘附实验从小鼠心脏小心抽取血液,用柠檬酸钠抗凝,分离获得血小板并稀释为2×109／ml,铺于方形的玻璃毛细管中,待血小板粘附于毛细管后,用凝血酶刺激激活血小板,连接小鼠的右颈动脉,使小鼠血液流过毛细玻璃管,在活体荧光显微镜下观察白细胞在血小板表而的滚动和粘附情况。11.血小板的激活,聚集及释放实验分离小鼠血小板后,洗涤血小板,在凝血酶、胶原和ADP刺激下,观察血小板IKKβ的敲除对血小板激活、聚集和释放的影响。12.流式细胞术利用流式细胞术,对分离血小板的纯度进行鉴定,并对血小板表面上的P-选择素、GPⅠbα、GPⅤ、GPⅥ、GPⅨ、αⅡbβ3等蛋白的量进行检测。13.血小板的电镜观察在凝血酶的刺激下,电镜下观察血小板的聚集及α颗粒的释放情况。14.蛋白印迹实验对血小板内在不同刺激下GPⅠbα、ADAM17、P38及p-P38的蛋白表达,采用western blotting的技术进行检测。结果1.西方饮食12周后,术发现血小板IKKβ的敲除对自发性动脉粥样硬化的形成有明显的影响（P>0.05）。2.血小板IKKβ的敲除,增加了颈动脉损伤后新生血管内膜的厚度,并增加了斑块内巨噬细胞的含量。骨髓移植实验,进一步确认了血小板IKKβ的敲除促进了新生血管内膜的增厚。3.血小板IKKβ的敲除没有对血小板在血管内皮表面上的粘附产生明显的影响,但增加了中心粒细胞在损伤血管内皮表面上的粘附。通过活体荧光显微镜观察,发现血小板IKKβ的的敲除对白细胞在损伤血管内皮或激活的血小板表面上的滚动没有明显的影响,但是明显增加了粘附在损伤血管内皮或激活的血小板表面上的白细胞的数量。4.血小板IKKβ的敲除,减轻了血小板的激活、聚集和释放：在凝血酶的刺激下,发现血小板激活的标志P选择素在IKKβ敲除的血小板中的表达受到明显的抑制。通过测量血小板的ATP的释放及电镜观察,发现IKKβ敲除后血小板的聚集和释放也受到了明显的抑制。5.血小板IKKβ的敲除,减少了血小板表面上GPⅠbα、GPⅤ的脱落,但对血小板表面GPⅥ、GPⅨ和αⅡbβ3的含量没有明显的影响。6.通过蛋白印迹技术发现,血小板IKKP的敲除能够减少P-38的磷酸化,阻止ADAM的成熟,进而减少GPIba的脱落。结论1.血小板IKKβ的敲除能够促进损伤血管的新生内膜增厚；2.血小板IKKβ的敲除增加了白细胞与血小板之间的相互作用,能够促进白细胞在损伤血管内皮表面上的粘附；3.血小板IKKβ的敲除能够抑制凝血酶等激活物引起的血小板的激活、聚集和释放；4.血小板IKKβ的敲除能够减少血小板表面GPIbα的脱落；5.血小板IKKβ的敲除能通过减少P-38的磷酸化,阻止ADAM17的成熟,减少GPIba的脱落。