论文摘要
大菱鲆是从欧洲引进的一种名贵经济鱼类，又称“多宝鱼”，营养丰富、味道鲜美、经济价值高，其养殖在我国已初步形成产业化，养殖前景看好。但目前大菱鲆鱼病的防治主要是大量使用抗生素和一些重金属化合物（如孔雀石绿等），造成鱼类耐药性增强、药物残留及重金属残留严重超标，使大菱鲆养殖业受到严重影响。因此，寻找新的抗生物质代替化学合成抗生素和重金属化合物的研究迫在眉睫。抗菌肽是一类具有广谱抗菌活性的小分子物质，是生物体天然免疫反应系统的重要成员，在生物体抵抗外界病原物感染过程中起着非常重要的作用。抗菌肽分布十分广泛，并且对真菌、大多数革兰氏阴性或阳性菌、原生动物都有抑制作用，有些抗菌肽还具有抗寄生虫、病毒和肿瘤的作用。本论文利用DNA重组技术，将大菱鲆抗菌肽hepcidin成熟肽片段的DNA序列插入pGAPZB表达载体，重组表达载体pGAPZB-TH电转化入巴氏毕赤酵母菌株X-33，通过对阳性转化子的表达情况进行分析，为开发转抗菌肽酵母作为鱼类饵料添加剂的应用提供理论基础。主要内容及结论如下：1．胞内表达载体的构建：提取大菱鲆肝脏总RNA并反转录成cDNA，根据大菱鲆hepcidin基因序列设计引物提取抗菌肽hepcidin基因成熟肽片段的DNA序列，并在目的片段后面加入凝血酶蛋白酶切位点。PCR得到的目的片段插入巴斯德毕赤酵母胞内表达载体pGAPZB中，构建了重组胞内表达载体pGAPZB-TH。2．表达载体的电转化及转化子的筛选：用BlnI单酶切重组表达载体后，用5～10ug的线性化质粒与山梨醇法制备的巴氏毕赤酵母X-33感受态细胞混匀冰浴后，在电转仪上以电压1.5KV、电容25uF、电阻200Q、电激4～5ms，转化入X-33。经过ZeocinTM抗性筛选和蜗牛酶法得到的转化子基因组PCR扩增筛选，分别得到了3株阳性转化子酵母菌株和3株阴性对照菌株。3．转化子Tricine SDS-PAGE及Western-blotting鉴定：转化子菌株及酵母X-33菌株经过YPD培养基在30℃，250 r／min培养后用蜗牛酶法提取胞内蛋白，TricineSDS-PAGE电泳显示阳性菌株在5.8kDa处有蛋白条带出现，而阴性对照菌株和酵母X-33菌株在相应位置则没有条带出现。Western-blotting分析表达的融合蛋白能与特异抗体anti-6his特异性结合，表明大菱鲆抗菌肽hepcidin基因在酵母菌中进行了表达。4．阳性转化子时间表达动态：转化子菌株在培养过程中，按照时间点0、12、24、48、72、96、120 h分别取培养基10mL，在600nm下测定OD值，后破壁菌体提取蛋白进行Tricine SDS-PAGE。阳性转化子时间表达结果显示：在0～48 h没有检测到外源蛋白的表达，在72 h时，酵母胞内有微量的蛋白出现，在96 h时表达量最大。