兔出血症病毒衣壳蛋白VP60基因片段的原核与真核表达

论文摘要

兔瘟（Rabbit hemorrhagic disease，RHD）又称兔病毒性出血病，是由兔出血病病毒（rabbit hemorrhagic disease virus，RHDV）引起的一种急性高致死性兔传染病，研究该病对于经济学和生态学均具有重大意义。该病的特征病变表现为肝脏坏疽、出血和高死亡率。RHDV属于嵌杯病毒属，病毒粒子直径30-40nm，仅有一个较大的衣壳蛋白（60kDa），基因组长7.5kb，为单股正链RNA，并含有一个长2.2kb的亚基因组RNA。由于兔出血病病毒不能在现有的细胞系中培养，重组DNA技术成为获得病毒蛋白及其特征研究的重要手段。目前尚需要建立一个检测PHDV疫苗免疫后的抗体效价的方法，而这一方法的基础就是要获得RHDV核衣壳蛋白作为包被抗原。通过RT-PCR方法从感染RHDV的家兔肝脏中获得了RHDV VP60基因的cDNA序列，命名为VP60-A，并将其克隆到载体pUC19中进行测序。序列分析显示，该cDNA与其它中国分离株同源性超过93％，而它们编码的氨基酸序列同源性更高达96％。分别位于衣壳蛋白编码基因中706-1740位和850-1365位（VP60-B和VP60-C）的两个片段也通过同样的方法进行了克隆。随后，将这些VP60编码基因克隆到原核表达载体pET-30a，构建了重组质粒pET-VP60A、pET-VP60B和pET-VP60C。三种RHDV衣壳蛋白基因均在大肠杆菌中获得了表达。Western blotting显示VP60-A和VP60B-能够与RHDV阳性血清反应，而VP60-C不能与之反应。重组VP60蛋白的免疫学活性用RHDV阳性血清通过ELISA方法进行检测。结果表明，在相同的浓度下，VP60-A对RHDV阳性血清的免疫反应性强于VP60-B和VP60-C(OD492值相对较高)，故VP60-A适于作为ELISA的包被抗原。优化后的ELISA反应条件为抗原浓度30μg／mL，阳性血清100倍稀释。仔兔出生后10天，母源抗体呈现快速下降的趋势，此后至20日龄，抗体水平继续下降，但速度较慢。用0.5ml，1.0ml和1.5ml灭活组织疫苗免疫30日龄家兔后20天抗体水平才开始上升，35-40天达到最高峰，45天后开始呈现下降的趋势。免疫1.0ml疫苗的抗体水平高于0.5ml和1.5mlVP60全长蛋白和蛋白片段还在杆状病毒系统中进行了表达。VP60-A片段从pET-VP60A载体酶切并插入杆状病毒表达系统pFastBac HT A，构建重组载体；而VP60-B和VP60-C片段则通过PCR扩增后，同样插入到载体pFastBac HT A中。构建完成的重组载体转化大肠杆菌DH10Bac进行培养以获得大量重组载体。抽提重组载体，转染昆虫细胞Sf9，27℃培养120h后，重组VP60蛋白获得了表达。由于蛋白表达量较低，SDS-PAGE检测不能看到重组蛋白条带。但Western blotting显示，在Bac-VP60A转染细胞培养上清液和细胞裂解产物中有一条80kDa的VP60-A蛋白条带，表明真核表达的VP60-A蛋白具有较高的抗原性。用免疫荧光方法检测发现仅转染重组病毒的Sf9细胞发出荧光，再次证明了这一点。作为RHDV唯一的结构蛋白，VP60能够自主装配为病毒样颗粒（VLPs），将转染不同重组病毒的细胞培养上清液和细胞裂解液用透射电镜进行观察，结果仅在Bac-VP60A转染的细胞样品中观察到了VP60-VLPs的存在，空Sf9细胞、未重组杆状病毒转染细胞和Bac-VP60B、Bac-VP60C转染细胞中均无VLPs出现。基于以上研究，RHDV衣壳蛋白的抗原性与蛋白长度有关，在大肠杆菌和杆状病毒中表达的VP60-A蛋白抗原性和免疫反应性强于B和C片段，能够用于检测自然感染或人工免疫产生的抗RHDV抗体。由于RHDV没有合适的细胞系进行繁殖，若要用全病毒作为包被抗原进行ELISA，就只能通过人工感染家兔并从肝脏分离获得病毒抗原，这显然不实用。重组VP60蛋白易获得，可以作为ELISA的包被抗原检测抗RHDV抗体，而杆状病毒系统虽能表达VP60蛋白，且能够装配成病毒样颗粒，但要作为亚单位蛋白表达用于ELISA或免疫，还需探索提高其表达量的方法。

论文目录

• Abstract
• Abstract （in Chinese）
• Introduction
• Chapter 1-Rabbit hemorrhagic disease and its causative agent
• Section A-Rabbit hemorrhagic disease: An introduction
• Section B-Rabbit hemorrhagic disease virus: structure, genome and variants
• Chapter 2-VP60 capsid protein: Structure and expression as subunit vaccine in heterologous systems
• 2.1 RHDV capsid structure
• 2.2 Expression of VP60 protein as subunit vaccine in heterologous systems
• References
• Chapter 3-Cloning of RHDV VP60 capsid gene fragments
• 3.1 Design of primers
• 3.2 Isolation of total RNA from RHDV-infected livers
• 3.3 Reverse transcriptase-polymerase chain reaction （RT-PCR）
• 3.4 Cloning of VP60 gene fragments into pUC19 plasmid
• 3.4.1 Preparation of inserts
• 3.4.2 Preparation of the pUC19 plasimd for ligation
• 3.4.3 Ligation of insert DNAs with pUC19 plasmid DNA
• 3.4.4 Transformation of competent E.coli DH5α cells with pUC constructs
• 3.5 Results
• 3.6 Discussion
• Chapter 4-Expression of VP60 gene fragments in E.coli
• 4.1 Overview of pET Expression System
• 4.2 Cloning of VP60 gene fragments into pET-30a
• 4.2.1 Preparation of VP60 gene inserts
• 4.2.2 Preparation of the pET30-a plasimd for ligation
• 4.2.3 Ligation of insert DNAs with pET-30a plasmid DNA
• 4.2.4 Transformation of competent E.coli cells with pET constructs
• 4.3 Expression of full and partial-length RHDV VP60 Proteins in E.coli: induction, identification and purification
• 4.3.1 Optimization of expression conditions
• 4.3.2 Identification of proteins by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis
• 4.3.3 Expression and purification of His-tagged proteins
• 4.3.4 Regeneration of Ni-NTA agarose beads
• 4.4 Results
• 4.5 Discussion
• Chapter 5-Immunoreactivity of full and partial-length RHDV VP60 Proteins
• 5.1 Raising RHDV anti-serum
• 5.2 Determination of protein concentrations by the method of Bradford
• 5.3 Testing the immunoreactivity of VP60 proteins and development of an ELISA formeasuring antibody response to vaccination
• 5.3.1 Enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）
• 5.3.2 Western blotting
• 5.4 Evaluation of ELISA using the field serum samples
• 5.5 Results
• 5.6 Discussion
• Chapter 6-Expression of VP60 gene fragments in Sf9 insect cell line
• 6.1 Overview of Bac-to-Bac baculovirus expression system
• 6.2 Cloning of VP60 gene fragments into pFastBac HT A plasmid
• 6.2.1 Preparation of inserts
• 6.2.2 Preparation of the pFastBac HT A plasimd for ligation
• 6.2.3 Ligation of insert DNAs with pFastBac HT A plasmid DNA
• 6.2.4 Transformation of competent E.coli cells with pFastBac constructs
• 6.3 Generation of recombinant baculoviruses and protein expression
• 6.3.1 Generation the recombinant bacmids
• 6.3.2 Production of recombinant baculoviruses
• 6.3.3 Expressing the recombinant proteins
• 6.4 Testing the immunoreactivity of VP60 proteins
• 6.4.1 Western blot analysis
• 6.4.2 Immunofluorescence assay
• 6.5 VLPs preparation and electron microscopy
• 6.6 Results
• 6.7 Discussion
• Conclusion
• References