苎麻高效再生体系的建立及抗虫Bt基因的遗传转化

论文摘要

本研究采用中苎一号、湘苎二号、湘苎三号、X1等4个不同苎麻品种的盆栽叶片为外植体,研究了不同消毒时间、不同培养基、不同生长调节物质对苎麻叶片愈伤诱导、不定芽的发生、增殖壮苗和生根的影响,筛选出了4个品种可共用的高效组织培养再生体系,并在此基础上,利用农杆菌介导法将Bt抗虫基因导入苎麻优良品种中苎一号,探索苎麻遗传转化的技术参数,为今后利用基因工程技术对苎麻进行遗传改良打下基础。本研究主要结果如下：（1）本研究采用升汞做为消毒剂,对不同消毒时间的消毒效果进行了比较,发现先用75%酒精消毒10秒,再用0.1%升汞灭菌8分钟（滴入1-2滴1%HC1）效果较好。（2）愈伤诱导阶段在培养基中添加不同浓度的TDZ、IAA、2,4-D后发现,叶片接种在R1+0.05 mg/L TDZ+0.01 mg/L IAA+0.03 mg/L 2,4-D中,愈伤诱导率达72.27%。（3）将苎麻叶片愈伤接种在设置了不同浓度的TDZ、IAA、2,4-D的培养基中,发现在R1+0.5 mg/L TDZ+0.02 mg/L 2,4-D+0.03 mg/L IAA中,愈伤分化率达32.16%。（4）将苎麻无根苗接种在设置了不同浓度的TDZ、IAA培养基中,发现在R1+TDZ（0.05 mg/L）+IAA（0.05 mg/L）中,苗生长快,茎肥大,叶片葱绿。（5）将壮苗后的无根苗接种在MS+0.02 mg／L TDZ+0.05 mg/L NAA+0.02 mg/LIAA中,无根苗生根率达100%,苗生根数多,植株生长良好。（6）选择中苎一号无菌种苗的叶片为外植体,研究了kan浓度、Cef浓度、预培养时间、菌液浓度、侵染时间、共培养时间对苎麻遗传转化的影响,发现愈伤诱导阶段Kan浓度为50 mg/L,生根阶段Kan浓度为30 mg/L,Cef浓度为500 mg/L,预培养2 d,菌液浓度在OD值0.6,侵染10 min,共培养36 h为遗传转化的技术参数,得到了3株转化植株,对获得的中苎一号再生植株进行扩繁,并进行PCR检测,证实Bt基因已经整合到其中一株中苎一号再生植株中。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩写词表
• 第一章 前言
• 1 研究目的和意义
• 1.1 研究目的
• 1.2 研究意义
• 2 国内外研究动态
• 2.1 苎麻再生体系的研究
• 2.1.1 基因型
• 2.1.2 外植体类型
• 2.1.2.1 叶片
• 2.1.2.2 茎切段
• 2.1.2.3 下胚轴
• 2.1.3 基本培养基
• 2.1.4 激素
• 2.1.4.1 激素对愈伤组织诱导的影响
• 2.1.4.2 激素对愈伤组织分化的影响
• 2.2 苎麻的遗传转化研究
• 3 影响作物遗传转化效率的主要因素
• 3.1 外植体的类型
• 3.2 外植体的预培养时间
• 3.3 共培养时间
• 3.4 选择压的筛选
• 第二章 苎麻组织培养再生体系的建立
• 1 试验材料与方法
• 1.1 植物材料
• 1.2 试验方法
• 1.2.1 外植体的采集与消毒
• 1.2.2 基本培养基
• 1.3 各诱导阶段使用的激素组合
• 1.4 培养过程
• 1.4.1 苎麻愈伤组织的诱导
• 1.4.2 苎麻愈伤组织的分化
• 1.4.3 分化芽的增殖和壮苗培养
• 1.4.4 分化芽苗的生根培养
• 1.4.5 组织再生苗的移栽
• 1.5 数据处理及方法
• 2 结果与分析
• 2.1 不同消毒时间对苎麻叶片外植体的消毒效果
• 2.2 不同培养基对苎麻愈伤组织诱导的影响
• 2.3 不同浓度TDZ、IAA、2,4-D浓度组合对苎麻愈伤组织诱导的影响
• 2.4 不同浓度TDZ、IAA、2,4-D对苎麻愈伤组织分化的影响
• 2.5 不同TDZ、IAA、2,4-D组合对苎麻单苗增殖和壮苗培养的影响
• 2.6 不同培养基及其不同激素组合对苎麻再生苗生根的影响
• 2.6.1 不同培养基对苎麻再生苗生根的影响
• 2.6.2 不同激素种类及不同浓度对苎麻再生苗生根的影响
• 2.7 不同温度、光照处理对苎麻组培苗移栽和生长的影响
• 3 结论
• 4 讨论
• 4.1 关于植物组织培养外植体的消毒方法
• 4.2 不同培养基和不同激素对苎麻愈伤组织诱导的影响
• 4.3 不同浓度TDZ、IAA、2,4-D对苎麻愈伤组织分化的影响
• 4.4 培养基、激素对苎麻苗增殖和壮苗生根的影响
• 第三章 农杆菌介导的苎麻遗传转化研究
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.1.1 主要化学试剂
• 1.1.2 常用溶液配方
• 1.2 试验方法
• 1.2.1 材料的准备
• 1.2.2 培养基
• 1.2.3 根癌农杆菌的培养
• 1.2.4 遗传转化步骤
• 1.2.5 卡那霉素（Kan）有效选择压的确定
• 1.2.5.1 Kan对无菌苗叶片愈伤选择压力的确定
• 1.2.5.2 Kan对再生苗生根的选择压力确定
• 1.2.6 不同剂量的Cef试验
• 1.2.7 遗传转化效率因素的优化
• 1.2.7.1 外植体预培养
• 1.2.7.2 农杆菌菌液浓度
• 1.2.7.3 菌液侵染时间
• 1.2.7.4 共培养时间
• 1.2.8 转基因植株的PCR检测
• 1.2.8.1 植物基因组DNA的提取（CTAB法略加改进）:
• 1.2.8.2 引物设计及PCR扩增程序
• 2 结果与分析
• 2.1 卡那霉素（Kan）浓度对苎麻叶愈伤诱导和分化的影响
• 2.2 卡那霉素浓度对苎麻再生苗生根的选择压力确定
• 2.3 预培养时间对苎麻遗传转化的影响
• 2.4 菌液浓度对苎麻抗性芽率的影响
• 2.5 侵染时间对苎麻遗传转化效率的影响
• 2.6 共培养时间对苎麻遗传转化效率的影响
• 2.7 抑菌剂对苎麻叶片不定芽分化的影响
• 2.8 苎麻转基因植株的检测
• 3 结论
• 4 讨论
• 4.1 抗生素浓度和抑制剂浓度对苎麻转化的影响
• 4.2 预培养时间、侵染时间、菌液浓度及共培养时间对苎麻转化的影响
• 附1 版图与说明
• 附2 论文中所用MS培养基成分及工作浓度
• 参考文献
• 致谢
• 作者介绍