猪碱性氨基酸转运载体cDNA克隆及其mRNA表达与调控

论文摘要

碱性氨基酸转运载体功能担负着碱性氨基酸在细胞膜上的跨膜运输功能。其中,转运系统b0,+和y+L和y+系统担负着大部分碱性氨基酸的转运任务;对于猪来说,碱性氨基酸转运系统的功能研究尚属一个全新的领域,而其cDNA的全序克隆是认识这一全新领域的必要基础。为研究猪碱性氨基酸吸收的分子机制及调控,本论文开展了以下五个试验。试验一进行了猪碱性氨基酸转运载体rBAT、4F2hc的cDNA序列电子克隆及序列验证。利用NCBI上已经公布的人4F2hc、rBAT的cDNA序列,检索EST（None Human & Mouse）数据库获得猪的若干EST序列,利用生物信息学软件分析以后电子克隆得出4F2hc、rBAT的全部或者部分序列。并据此设计引物通过RT-PCR来验证其部分序列。结果表明:（1）猪rBAT的cDNA全长2487bp,其中包含一段5’和3’UTR,CDS长2049 bp,和人rBAT同源性为77.4%,编码区同源性达85.7%,推测蛋白的同源性高达87%。（2）克隆到猪4F2hc cDNA长度为1730bp的部分片段,与人4F2hc cDNA序列进行同源性比较分析发现,同源性为80.2%。（3）通过RT-PCR的方法进行了部分序列的验证,结果表明,电子克隆的序列基本可靠,测序序列和电子克隆序列同源性高达98.4%,99.4%,99.5%和98.2%。试验二进行了猪碱性氨基酸转运载体b0,+AT、y+LAT1基因的cDNA克隆。根据GenBank中的公布序列或EST序列设计引物,采用RACE的方法,以6日龄长白猪肠道组织mRNA为模板,克隆了b0,+AT、y+LAT1的cDNA序列。结果表明:（1）猪b0,+AT-1的cDNA全长1680bp,包含一个1464bp的ORF,编码487个氨基酸残基。5’ UTR长90bp,3’ UTR长126 bp。b0,+AT-2的cDNA全长1488bp,包含一个1272bp的ORF,编码423个氨基酸残基。在polyA尾上游7–12 nt有一个AATAAA的加尾信号序列。b0,+AT-2在编码区比b0,+AT-1少192bp,少编码64个氨基酸残基。序列分析显示b0,+AT-2和人b0,+AT、小鼠b0,+AT以及猪b0,+AT-1编码区序列的同源性分别高达75.1%、71.9%和86.6%。（2）猪y+LAT1 cDNA全长2111 bp,包含一个1536bp的ORF,编码511个氨基酸残基。5’ UTR长134bp,3’ UTR长441 bp,在polyA尾上游15–20 nt有一个AATAAA的加尾信号序列。序列分析显示其和小牛、人、小鼠、大鼠y+LAT1 cDNA具有高度的同源性,尤其CDS区的同源性分别高达91%,90%,87%和87%;编码蛋白的同源性分别为93.2%、92.4%、88.5%和88.9%。试验三研究了猪肠道碱性氨基酸转运载体rBAT和4F2hc mRNA表达的发育模式。分别采集1、7、26、30、60、90和150日龄的蓝塘和长白两品种猪十二指肠、空肠和回肠组织样品,采用实时荧光定量PCR方法,检测猪rBAT及4F2hc在不同肠段中的表达模式。结果表明:（1）蓝塘和长白猪十二指肠、空肠和回肠rBAT和4F2hc mRNA表达的发育性变化随肠段、时间、品种的不同而呈现差异。断奶前（28d断奶）后rBAT和4F2hc mRNA的表达丰度不受影响。（2）蓝塘和长白猪十二指肠和空肠的4F2hc mRNA表达模式比较相似。蓝塘猪在7d表达丰度最高,长白猪在60d表达丰度达到顶峰。（3）蓝塘和长白猪十二指肠、空肠和回肠rBAT和4F2hc mRNA表达的发育性变化分别和其轻链b0,+AT和y+LAT1的mRNA表达相比,表达各有不同,没有线性关系。试验四研究了猪碱性氨基酸转运载体b0,+AT、y+LAT1、rBAT和4F2hc基因mRNA表达的组织特异性。采集初生杂交仔猪心、肝、肺、肠、肾、脑和肌肉组织样品,提取组织样品的总RNA并进行反转录;用实时荧光定量PCR方法,检测猪b0,+AT、y+LAT1、rBAT和4F2hc在不同组织中的表达丰度。结果表明:（1）猪4F2hc mRNA在脑、肺、肝、肾、肌肉、肠、心脏都有一定的表达,而在肠道表达最高,其次是在脑和肺组织,在肝、肾、肌肉、心脏等组织的表达量比较低。（2）猪rBAT mRNA在脑、肺、肝、肾、肌肉、肠都有一定的表达,而在肠道表达最高,其次是在脑、肌肉和肾组织,在肝、肺等组织的表达量比较低。在心脏组织中表达更低,几乎没有可以检测的表达。（3）猪b0,+AT mRNA在肾、肌肉、肠和心脏都有一定的表达,而在肠道表达最高,其次是在肾和心组织,在肌肉组织的表达量比较低。而在肝、肺、脑组织中几乎没有可以检测的表达。（4）y+LAT1 mRNA在肾、肺、肠和心脏都有一定的表达,而在肠道表达最高,其次是在心脏组织,在肾和肺组织的表达量比较低。而在肝、肌肉、脑组织中几乎没有可以检测的表达。试验五通过建立猪肠上皮细胞原代培养的方法,研究了赖氨酸对体外培养的猪小肠粘膜上皮细胞碱性氨基酸转运载体mRNA表达的影响。采用刚出生（未吮乳）的仔猪小肠组织,用机械刮取小肠粘膜加胶原酶Ⅱ消化的方法,成功地在体外培养了新生仔猪IEC;在DMEM–F12培养基中,细胞在12d内贴壁,56d形成细胞克隆,9-11d融合成片;经碱性磷酸酶与免疫细胞化学鉴定为阳性细胞。分别用浓度为0.5 mM、2mM、8mM赖氨酸处理细胞96小时,提取细胞总RNA,采用实时荧光定量PCR方法,检测碱性氨基酸转运载体在不同处理细胞中的表达丰度。结果表明:（1）高浓度的赖氨酸对CAT-1 mRNA的表达均有上调作用,差异极显著（P<0.01）,并且呈剂量依赖效应。（2）不同浓度的赖氨酸对CAT-2 mRNA的表达影响不大,8mM和2mM赖氨酸组CAT-2 mRNA的表达丰度均有低于0.5mM的趋势,但二者之间差异不显著（P>0.05）;（3）不同浓度的赖氨酸对y+LAT1 mRNA表达影响差异不显著（P>0.05）。（4）高浓度的赖氨酸可提高4F2hc mRNA的表达。0.5mM和2mM赖氨酸组4F2hc mRNA的表达丰度均低于8mM,且差异显著（P<0.05）,0.5mM和2mM赖氨酸组之间差异不显著（P>0.05）。

论文目录

摘要

Abstract

前言

第一章猪肠道碱性氨基酸转运载体RBAT、4F2HC 的电子克隆及序列验证

1 试验材料

1.1 菌种和质粒

1.2 主要试剂及试剂盒

1.3 主要仪器设备

1.4 试剂配制

1.4.1 PBS 缓冲液

1.4.2 LB 培养基

1.4.3 TE 缓冲液

1.4.4 50 X TAE 电泳缓冲液pH8.0 （1L）

1.4.5 其它试剂

1.5 试验动物

2 试验方法

2.1 猪rBAT、4F2hc 基因EST 序列检索

2.2 猪rBAT、4F2hc 基因EST 序列与人的比对分析、电子克隆

2.3 猪rBAT、4F2hc 基因的RT-PCR 克隆验证

2.3.1 组织样品采集

2.3.2 总RNA 的提取及纯化

2.3.2.1 总RNA 的提取

2.3.2.2 总RNA 的普通琼脂糖凝胶电泳

2.3.2.3 总RNA 的消化

2.3.2.4 1%琼脂糖凝胶电泳

2.3.3 猪肠道组织cDNA 合成

2.3.4 PCR 扩增rBAT、4F2hc 基因cDNA 部分序列

2.3.5 1%琼脂糖凝胶电泳

2.3.6 PCR 产物回收

2.3.7 目的基因片段的T/A 克隆

2.3.7.1 目的基因与T 载体的连接

2.3.7.2 大肠杆菌感受态细胞的制备

2.3.7.3 重组质粒的转化

2.3.7.4 克隆转化子的扩大培养

2.3.7.5 重组质粒的PCR 鉴定

2.3.8 序列测定

2.3.9 序列比对分析

3 结果与分析

3.1 猪EST 序列的检索

3.2 猪rBAT、4F2hc 基因cDNA 序列的电子克隆

3.3 猪rBAT、4F2hc 基因cDNA 序列的试验验证

3.3.1 猪肠道总RNA 制备

3.3.2 RT-PCR 结果

3.3.3 重组质粒的鉴定

3.3.4 克隆片段的核苷酸序列和同源性比较

4 讨论

5 小结

0,+AT、Y⁺LAT1 的分子克隆'>第二章猪肠道碱性氨基酸转运载体B^0,+AT、Y⁺LAT1 的分子克隆

1 试验材料

1.1 菌种和质粒

1.2 主要试剂及试剂盒

1.3 主要仪器设备

1.4 试剂配制

1.5 试验动物

2 试验方法

0,+AT、y⁺LAT1 cDNA 部分序列的获取'>2.1 b^0,+AT、y⁺LAT1 cDNA 部分序列的获取

0,+AT 部分序列和y⁺LAT1 的EST 序列检索及引物设计'>2.1.1 b^0,+AT 部分序列和y⁺LAT1 的EST 序列检索及引物设计

2.1.2 组织样品采集

2.1.3 猪肠道总RNA 的提取

0,+AT、y⁺LAT1 已知片段至Poly A 尾端克隆（3'RACE）'>2.2 b^0,+AT、y⁺LAT1 已知片段至Poly A 尾端克隆（3'RACE）

2.2.1 SMART 3' cDNA 快速扩增（3'RACE）原理

2.2.2 引物设计

2.2.3 cDNA 第一链合成

2.2.4 用GSP2 和UPM 进行第一轮PCR 扩增

2.2.5 用NGSP2 和NUP 进行第二轮（nest）PCR 扩增

2.2.6 PCR 产物回收

2.2.7 3'RACE 产物的T/A 克隆

2.2.8 序列测定

2.2.9 序列比对分析

0,+AT、y⁺LAT1 已知片段至5'UTR 的克隆（5'RACE）'>2.3 b^0,+AT、y⁺LAT1 已知片段至5'UTR 的克隆（5'RACE）

2.3.1 SMART 5' cDNA 末端快速扩增（5'RACE）原理

2.3.2 引物设计

2.3.3 cDNA 第一链合成

2.3.4 用GSP1 和UPM 进行第一轮PCR 扩增

2.3.5 用NGSP1 和NUP 进行第二轮（nest）PCR 扩增

2.3.6 PCR 产物回收

2.3.7 5'RACE 产物的T/A 克隆

2.3.8 序列测定

2.3.9 序列比对分析

0,+AT、y⁺LAT1 全基因序列ORF 的克隆'>2.4 b^0,+AT、y⁺LAT1 全基因序列ORF 的克隆

2.4.1 引物设计

2.4.2 PCR 扩增

2.4.3 重组质粒的构建及克隆（T/A 克隆）及测序

0,+AT、y⁺LAT1 的序列分析'>2.5 b^0,+AT、y⁺LAT1 的序列分析

3 结果与分析

3.1 猪肠道总RNA 提取

3.2 3'RACE 结果

3.3 5'RACE 结果

3.4 序列拼接

3.5 ORF 的克隆

0,+AT、y⁺LAT1 的序列分析'>3.6 b^0,+AT、y⁺LAT1 的序列分析

0,+AT、y⁺LAT1 的核酸序列分析'>3.6.1 b^0,+AT、y⁺LAT1 的核酸序列分析

0,+AT、y⁺LAT1 的蛋白序列分析'>3.6.2 b^0,+AT、y⁺LAT1 的蛋白序列分析

3.6.2.1 理化性质分析

3.6.2.2 跨膜区分析

3.6.2.3 蛋白质序列比对及功能预测

4 讨论

5 小结

第三章猪肠道碱性氨基酸转运载体RBAT、4F2HC 的 MRNA 表达发育性变化

1 试验材料

1.1 菌种和质粒

1.2 主要试剂和试剂盒

1.3 主要仪器设备

1.4 试剂配制

1.5 试验动物与饲养

1.5.1 日粮组成及营养水平

1.5.2 饲养管理

2 试验方法

2.1 组织采样

2.1.1 总RNA 的提取及纯化

2.1.2 猪肠道组织cDNA 的合成

2.1.3 引物的设计

2.1.4 PCR 扩增rBAT、4F2hc 基因cDNA 部分序列

2.1.5 PCR 产物回收

2.1.6 目的基因片段的T/A 克隆

2.1.7 重组质粒的提取

2.1.8 序列测定

2.1.9 序列比对分析

2.1.10 荧光定量PCR

2.1.11 通过标准曲线筛选引物和模板的浓度

2.1.12 实时荧光定量PCR 反应体系

2.2 数据分析

3 结果与分析

3.1 总RNA 的提取

3.2 各目的基因RT-PCR 产物测序结果

3.3 RFQ-PCR 标准曲线的建立

3.4 猪肠道组织cDNA 的荧光定量结果

3.4.1 长白和蓝塘猪十二指肠rBAT、4F2hc m RNA 表达的发育性变化

3.4.1.1 十二指肠rBAT mRNA 表达的发育性变化

3.4.1.2 十二指肠4F2hc mRNA 表达的发育性变化

3.4.2 长白和蓝塘猪空肠rBAT、4F2hc m RNA 表达的发育性变化

3.4.2.1 空肠rBAT mRNA 表达的发育性变化

3.4.2.2 空肠4F2hc mRNA 表达的发育性变化

3.4.3 长白和蓝塘猪回肠rBAT、4F2hc m RNA 表达的发育性变化

3.4.3.1 回肠rBAT mRNA 表达的发育性变化

3.4.3.2 回肠4F2hc mRNA 表达的发育性变化

4 讨论

4.1 荧光定量的试验方法及数据统计

4.2 rBAT 和4F2hc m RNA 在猪肠道中的发育性表达谱

5 小结

第四章猪肠道碱性氨基酸转运载体MRNA 表达的组织特异性

1 试验材料

1.1 菌种和质粒

1.2 主要试剂和试剂盒

1.3 主要仪器设备

1.4 试剂配制

1.5 试验动物

2 试验方法

2.1 组织采样

2.2 总RNA 的提取及纯化

2.3 猪各个组织cDNA 的合成

2.4 引物的设计

2.5 PCR 扩增rBAT、4F2hc 基因cDNA 部分序列

2.6 PCR 产物回收

2.7 目的基因片段的T/A 克隆

2.8 重组质粒的提取

2.9 序列测定

2.10 序列比对分析

2.11 荧光定量PCR

2.12 数据分析

3 结果与分析

3.1 总RNA 的提取

3.2 猪4F2hc mRNA 表达的组织特异性

3.3 猪rBAT mRNA 表达的组织特异性

0,+AT mRNA 表达的组织特异性'>3.4 猪b^0,+AT mRNA 表达的组织特异性

+LAT1 mRNA 表达的组织特异性'>3.5 猪y⁺LAT1 mRNA 表达的组织特异性

4 讨论

5 小结

第五章不同赖氨酸对体外培养的IEC 碱性氨基酸转运载体MRNA 表达的调控

1 试验材料

1.1 试验动物

1.2 主要仪器设备

1.3 主要试剂及配制方法

1.3.1 DMEM/F12 基础培养基的配制

1.3.2 DMEM/F12 完全培养基（含双抗）的配制

1.3.3 1%胶原酶Ⅱ型（10×母液）的配制

1.3.4 PBS 缓冲液（pH=7.2）的配制

1.3.5 赖氨酸溶液（Sigma）（100mM）的配制

2 试验方法

2.1 猪小肠黏膜上皮细胞的分离培养

2.2 传代培养

2.3 赖氨酸对IEC 增殖的影响

2.4 猪IEC 的鉴定

2.4.1 碱性磷酸酶的鉴定

2.4.2 免疫学方法鉴定

2.5 不同赖氨酸浓度处理猪IEC 细胞

2.6 总RNA 的提取和纯化

2.7 cDNA 第一链的合成

2.8 实时荧光定量PCR

3 结果与分析

3.1 猪IEC 的分离培养

3.2 猪IEC 的鉴定

3.2.1 碱性磷酸酶的鉴定

3.2.2 免疫学方法鉴定

3.3 赖氨酸对IEC 增殖的影响

3.4 总RNA 的提取

3.5 赖氨酸对猪碱性氨基酸转运载体mRNA 表达的影响

3.5.1 赖氨酸对CAT-1 mRNA 表达的影响

3.5.2 赖氨酸对CAT-2 mRNA 表达的影响

+LAT1 mRNA 表达的影响'>3.5.3 赖氨酸对y⁺LAT1 mRNA 表达的影响

3.5.4 赖氨酸对4F2hc mRNA 表达的影响

0,+AT、rBAT mRNA 表达的影响'>3.5.5 赖氨酸对b^0,+AT、rBAT mRNA 表达的影响

4 讨论

4.1 猪IEC 的原代培养

4.2 猪IEC 转运载体mRNA 的表达调控

5 小结

结论

创新点

致谢

参考文献

附录A 文献综述动物碱性氨基酸转运载体研究进展

附录B 技术路线

附录C：部分测序图谱（以ORF 测序为代表）

附录D：荧光定量曲线

附录E：在学期间参加的科研课题、学术活动及发表的论文

猪碱性氨基酸转运载体cDNA克隆及其mRNA表达与调控

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