猪戊型肝炎病毒WH09株全基因组分析及ORF2单克隆抗体的制备

论文摘要

戊型肝炎病毒（Hepatitis E Virus, HEV）属于戊肝病毒科,是一种无囊膜的单股正链RNA病毒,感染动物和人,引起戊型肝炎（Hepatitis E, HE）。HEV分为1、2、3、4四个基因型,其中1、2型只感染人,3、4感染动物和人,尤其在猪群中的阳性率非常高,猪也是HEV最主要的贮存宿主。目前已有大量有关猪HEV部分核酸序列的报道,但全基因组的报道较少,而全基因组序列分析有利于人们更好地了解HEV不同毒株之间的进化关系。鉴于此,本研究对一株HEV进行了全基因组序列分析,并制备了针对HEV ORF2编码蛋白的单克隆抗体,具体研究内容如下：1.HEV WH09株全基因组序列扩增与分析通过RT-nPCR方法,武汉市郊某猪场猪粪便中检测到一株HEV,命名为WH09株。根据报道的HEV序列设计10对PCR引物,对全基因组进行分段扩增,两末端采用RACE方法扩增,获得HEV WH09株全基因组序列。基因组全长7265bp,包含3个开放阅读框（ORF）。ORF1、ORF2和ORF3分别编码1707、674和114个氨基酸。全基因组序列比对发现,WH09株与基因4型毒株的相似度为83.0%-86.2%,与其他三型HEV为73.2%-75.2%。基于全长基因组的进化树显示,猪源HEV WH09株属于基因4型,与日本人源毒株HE-JA2处在相对独立的分支上,与其他基因4型毒株亲缘关系较远。2. HEV ORF2编码蛋白单克隆抗体的制备有研究证实戊型肝炎病毒的ORF2编码蛋白的452-617aa（命名为sORF2）含有HEV中和抗原表位,能够诱导HEV特异性中和抗体的产生,并且能够形成病毒样颗粒。本研究以带有特定酶切位点的引物扩增sORF2基因,克隆到pMD18-T载体上,酶切及测序鉴定正确后构建原核表达质粒pET28a-sORF2,并在大肠杆菌中获得高效表达,表达蛋白分子量约为25kD,以可溶性蛋白存在,经Western blot检测证实所表达蛋白具有免疫学活性。将表达的蛋白纯化后以100μg/只的剂量免疫4周龄BALB/c小鼠,常规方法免疫3次后加强免疫后3天取脾细胞与SP2/0细胞进行融合。融合7天后以原核表达的sORF2蛋白包被酶标板进行筛选,经过3-5次克隆后获得9株能够稳定分泌抗HEV sORF2蛋白单克隆抗体的细胞株。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语表
• 第1章 文献综述
• 1.1 病毒形态学和理化特性
• 1.2 基因组结构
• 1.2.1 ORF1
• 1.2.2 ORF2
• 1.2.3 ORF3
• 1.3 HEV基因型
• 1.4 HEV流行病学
• 1.4.1 HEV基因型的地理分布
• 1.4.2 国外HEV的流行情况
• 1.4.3 我国HEV的流行状况
• 1.5 传染源
• 1.6 传播途径
• 1.7 易感人群
• 1.8 猪HEV的诊断
• 1.8.1 酶联免疫吸附实验（ELISA）
• 1.8.2 反转录套式聚合酶链反应（RT-nPCR）
• 1.8.3 免疫电镜法
• 1.8.4 免疫荧光法
• 1.9 猪HEV疫苗研究进展
• 第2章 研究目的与意义
• 第3章 材料与方法
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 病料
• 3.1.2 菌株
• 3.1.3 载体
• 3.1.4 工具酶及主要试剂
• 3.1.5 培养基及抗生素的配制
• 3.1.6 主要缓冲液与相关试剂及其配制
• 3.1.7 分子生物学分析软件
• 3.2 试验方法
• 3.2.1 病料采集与处理
• 3.2.2 病毒RNA的提取
• 3.2.3 反转录（RT）
• 3.2.4 HEV阳性样品的检测
• 3.2.5 HEV的分段克隆
• 3.2.6 扩增产物或酶切产物的回收与纯化
• 3.2.7 外源DNA片段与质粒载体的连接反应
• 3.2.8 大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备
• 3.2.9 连接产物的转化
• 3.2.10 质粒的小量制备
• 3.2.11 重组质粒的鉴定
• 3.2.12 HEV WH09株基因组序列分析
• 3.2.13 ORF2的原核表达
• 3.2.14 可溶性表达产物的提取
• 3.2.15 表达产物的Western blot检测
• 3.2.16 猪戊型肝炎病毒WH09株ORF2蛋白单克隆抗体的制备
• 第4章 结果与分析
• 4.1 HEV WH09株全基因组序列分析
• 4.1.1 HEV WH09株的发现
• 4.1.2 HEV WH09株基因组各片段的克隆、测序及序列拼接
• 4.1.3 HEV WH09株全基因组的结构分析
• 4.2 HEV WH09株ORF2单克隆抗体的制备
• 4.2.1 ORF2基因PCR扩增
• 4.2.2 重组质粒pET28a-sORF2的鉴定
• 4.2.3 重组蛋白的SDS-PAGE分析
• 4.2.4 重组蛋白的Western blot检测
• 4.2.5 间接ELISA筛选方法的建立
• 4.2.6 杂交瘤细胞株的获得
• 4.2.7 单抗特异性鉴定
• 第5章 讨论与结论
• 5.1 讨论
• 5.1.1 HEV阳性样品的选择
• 5.1.2 HEV WH09株全基因组的扩增
• 5.1.3 HEV WH09株全基因组的分析
• 5.1.4 猪戊型肝炎病毒WH09株ORF2部分片段的原核表达
• 5.1.5 猪戊型肝炎病毒WH09株ORF2部分片段单克隆抗体的制备
• 5.2 结论
• 参考文献
• 致谢