恶臭假单胞菌对双孢蘑菇的促生作用及其机理研究

论文摘要

恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）是蘑菇覆土层中优势菌群,可显著提高双孢蘑菇菌丝的生长速度及诱导并促进子实体的形成和发育,但其机理尚未见报道。本研究利用恶臭假单胞菌及其1-氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶（Acds）突变株与双孢蘑菇共培养或接种于灭菌覆土中来证实供试株对双孢蘑菇生长和出菇的影响,并尝试构建转恶臭假单胞菌Acds基因的双孢蘑菇工程菌,探讨恶臭假单胞菌对双孢蘑菇促生作用的机理。结果如下:（1）在平板上和试管中接种双孢蘑菇2796和恶臭假单胞菌UW4（P.putida UW4）或Acds突变株UW4-AcdS-共培养,与未接种细菌的对照和接种UW4-AcdS-相比,UW4大量附着在双孢蘑菇菌丝体表面,能够显著促进双孢蘑菇菌丝生长,及显著降低双孢蘑菇菌丝产生的乙烯量。UW4-AcdS-处理双孢蘑菇产生的乙烯量约是添加恶臭假单胞菌UW4处理的1.5倍。在双孢蘑菇试管培养基中可同时检测出1-氨基环丙烷-1-羧酸（ACC）。UW4促进双孢蘑菇菌丝生长和减少双孢蘑菇乙烯合成的效应与添加乙烯抑制剂CoCl2和AgNO3的效果相似。（2）为探讨恶臭假单胞菌UW4和UW4-AcdS-对双孢蘑菇子实体形成的影响,共设四个处理,分别是在灭菌的土中添加恶臭假单胞菌UW4或UW4-AcdS-、不灭菌土和灭菌土作为覆土材料。未灭菌土处理双孢蘑菇的原基形成时间早,形成数量多,子实体相对较大,灭菌土接种恶臭假单胞菌UW4处理双孢蘑菇原基形成时间稍迟于未灭菌土处理,原基的形成数量较多,但子实体略小,而灭菌土处理菌丝爬土速度较慢,原基形成的时间较晚,原基数少,灭菌土接种突变株UW4-AcdS-处理双孢蘑菇菌丝大部分老化,原基形成时间最晚,个数最少。（3）根据GeneBank中恶臭假单胞菌ACC脱氨酶基因的DNA序列设计引物,从恶臭假单胞菌UW4中克隆到该酶的基因,将基因连接到表达载体PET21a上,转化大肠杆菌BL21中,阳性转化子经诱导能够表达具有活性的ACC脱氨酶蛋白。（4）将恶臭假单胞菌UW4的ACC脱氨酶基因连接到真菌表达载体PAN7-1上,替换其中的潮霉素抗性基因hpt,构建PAN7-Acds。采用基因枪法,将PAN7-Acds和PAN7-1同时打入双孢蘑菇2796的菌褶中,在5μg/mL的潮霉素抗性平板上筛选,得到6个潮霉素抗性转化子,但是在传代过程中抗性逐渐消失。以上结果表明,在双孢蘑菇中可能存在有经ACC合成乙烯的途径,恶臭假单胞菌对双孢蘑菇的促生作用可能是通过其1-氨基环丙烷-1羧酸脱氨酶降解双孢蘑菇产生的ACC,从而减少了双孢蘑菇菌丝的乙烯合成,解除了乙烯对菌丝生长和子实体发育的抑制作用。双孢蘑菇覆土出菇的机理可能与此有关。如能成功构建表达恶臭假单胞菌ACC脱氨酶基因的双孢蘑菇转化子,将有助于进一步阐明双孢蘑菇覆土出菇的机理。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• 第一章 文献综述
• 1 概述
• 1.1 双孢蘑菇研究现状和存在问题
• 1.2 双孢蘑菇覆土出菇机理的研究现状
• 1.3 荧光假单胞菌
• 1.4 ACC 脱氨酶的研究进展
• 1.4.1 ACC 脱氨酶特征
• 1.4.2 ACC 脱氨酶的作用机理
• 1.5 食用菌遗传转化研究进展
• 1.5.1 PEG 介导的原生质体转化法
• 1.5.2 电激转化法
• 1.5.3 基因枪法
• 1.5.4 限制性内切酶介导的DNA 整合法
• 1.5.5 农杆菌介导转化法
• 1.6 研究目的和意义
• 第二章 恶臭假单胞菌对双孢蘑菇平板培养菌丝生理活性的影响
• 1 材料和方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 菌株
• 1.1.2 培养基
• 1.1.3 主要仪器设备
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 检测恶臭假单胞菌及其突变株是否具ACC 脱氨酶活性
• 1.2.2 菌丝生长速度测定
• 1.2.3 菌丝长度和直径测定
• 1.2.4 菌丝干重
• 1.2.5 菌丝乙烯含量的测定
• 1.2.6 菌丝体上菌膜的观测
• 2 结果与分析
• 2.1 供试菌的ACC 脱氨酶活性检测
• 2.2 菌丝生长速度测定
• 2.2.1 恶臭假单胞菌及ACC 脱氨酶突变株接种量对双孢蘑菇菌丝生长的影响
• 2.2.2 不同处理对双孢菇菌丝生长的影响
• 2.3 菌丝分支长度和直径测定
• 2.4 菌丝干重的测定
• 2.5 乙烯含量
• 2.6 菌膜的测定
• 3 本章小结
• 第三章 恶臭假单胞菌对双孢蘑菇试管培养菌丝生理活性的影响
• 1 材料和方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 菌株
• 1.1.2 培养料
• 1.1.3 试剂
• 1.1.4 主要仪器设备
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 菌丝生长速度测定
• 1.2.2 乙烯含量的测定
• 1.2.3 ACC 含量的测定方法
• 1.2.4 菌丝体菌膜的观测
• 1.2.5 漆酶活性的测定
• 2 结果与分析
• 2.1 菌丝生长速度
• 2.2 菌丝乙烯含量的测定和ACC 含量测定
• 2.3 菌膜的观测
• 2.4 漆酶活性的测定
• 3 本章小结
• 第四章 恶臭假单胞菌对双孢蘑菇子实体形成的影响
• 1 实验材料
• 1.1 供试菌株
• 1.2 培养料
• 1.3 栽培地点
• 2 试验方法
• 2.1 蘑菇出菇
• 2.1.1 原种制作
• 2.1.2 栽培料制作方法
• 2.1.3 播种
• 2.1.4 蘑菇出菇管理
• 2.1.5 播种后到出菇前的管理
• 2.1.6 覆土与管理
• 2.1.7 出菇管理
• 3 结果与分析
• 3.1 恶臭假单胞菌对双孢蘑菇出菇的影响
• 3.2 双孢蘑菇栽培试验灭菌覆土中添加恶臭假单胞菌对出菇的影响
• 4 本章小结
• 第五章 恶臭假单胞菌ACC 脱氨酶基因的克隆和GPD 启动子片段的获取
• 1 材料和方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 菌种和质粒
• 1.1.2 培养基配方
• 1.1.3 主要试剂
• 1.1.4 溶液配制
• 1.1.5 仪器
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 Acds 片段获取
• 1.2.2 Acds 功能基因的验证
• 1.2.3 GPD 启动子获取
• 2 结果与分析
• 2.1 Acds 片段扩增
• 2.2 Acds 测序比对结果
• 2.3 Acds 功能基因的验证
• 2.3.1 双酶切验证
• 2.3.2 α-丁酮酸含量的测定
• 2.4 GPD 启动子检测
• 2.4.1 GPD 启动子的扩增
• 2.4.2 GPD 启动子测序结果比对
• 3 本章小结
• 第六章 双孢蘑菇外源基因表达载体的构建及转化体系的研究
• 1 实验材料
• 1.1 供试菌株与质粒
• 1.2 培养基配方
• 1.3 主要试剂
• 2 实验方法
• 2.1 质粒DNA 提取
• 2.2 酶切反应
• 2.3 目的片段回收及转化
• 2.4 重组质粒的鉴定
• 2.5 载体构建的技术路线
• 2.6 双孢蘑菇外植体的准备
• 2.7 微弹的制备
• 2.8 质粒PAN7-1 和PAN7-Acds 的提取及纯化
• 2.8.1 质粒宿主菌的活化与培养
• 2.8.2 碱裂解法提取质粒DNA
• 2.8.3 质粒DNA 的纯化
• 2.8.4 基因枪转化
• 2.8.5 转化子的筛选与鉴定
• 2.9 双孢蘑菇菌丝体的潮霉素抗性的敏感性测验
• 2.9.1 培养基的配制
• 2.9.2 双孢蘑菇菌丝体的潮霉素抗性
• 3 结果与分析
• 3.1 重组子的PCR 验证
• 3.2 双孢蘑菇菌丝体的潮霉素抗性的敏感性测验
• 3.3 双孢蘑菇含潮霉素抗性转化子的筛选
• 3.3.1 含潮霉素抗性拟转化子的初筛
• 3.3.2 含潮霉素抗性转化子的复筛
• 3.3.3 PCR 鉴定含潮霉素抗性的阳性转化子
• 3.3.4 抗性转化子的遗传稳定性分析
• 4 本章小结
• 第七章 讨论
• 参考文献
• Abstract