单环刺螠纤溶酶UFE Ⅰ的酶学性质和初步药效学及安全性评价

论文摘要

血栓栓塞性疾病（thrombotic disease, TD）是严重危害公众健康的常见病与多发病,主要危害心、脑,肺等血管系统,具有较高的发病率、致残率和致死率。目前,药物溶栓是临床应用上主要的治疗手段。虽然溶栓剂已经发展了三代,但仍然存在诸多副作用,如特异性降解纤维蛋白能力低,易诱发机体出血等。因此,寻找和开发更为安全有效的新型溶栓剂是治疗血栓性疾病的重要内容。本实验室经过多年对海洋无脊椎动物单环刺螠（Urchis unicinctus）的探索研究,得到一种分子量为26 kDa的纤溶酶,并对其溶栓活性进行了研究,报道了该酶具有直接降解血栓纤维蛋白的能力,溶栓效果优于蚓激酶。本文将对分离纯化得到的新组分UFEⅠ进行研究,进一步丰富对单环刺螠体内活性物质的相关认识。主要研究结果如下:1.酶组分UFEⅠ经SDS-PAGE电泳呈单一条带,测定其相对分子质量约为45 kDa;IEF电泳图谱测定其pI值为4.58。2. UFEⅠ酶学性质研究:最适反应温度为50℃,最适反应pH为8.5;酶活力在50℃以下范围内具有良好的热稳定性,在pH 7.0-9.0内相对稳定;Mn2+和Fe3+是该酶的抑制剂,EDTA可以强烈抑制该酶的活力;纤维蛋白原为UFEⅠ的最适作用底物;米氏常数Km =1.02 mg/mL,最大反应速率Vmax= 34.5μg/min·mL。3. UFEⅠ具有直接纤溶活性和激酶活性。以纤维蛋白平板法,参照尿激酶标准品,测得该酶的总纤溶活力为每mg酶含302.9个尿激酶活力单位,其中激酶活性为每mg酶含177.6个尿激酶活力单位,约占酶总纤溶活力的41.4%。4.体外抗凝指标的检测初步推断UFEⅠ的体外抗凝血作用于内凝血途径和共同凝血途径,并可降低纤维蛋白原含量,抑制血栓的形成;体外定量溶栓实验表明,UFEⅠ具有体外直接溶解纤维蛋白的能力。5.根据对UFEⅠ降解纤维蛋白原产物分析,发现该酶可以迅速降解γ链,随后于4 h完全降解β链,推测UFEⅠ为γ-纤溶酶。6. UFEⅠ对小鼠体内凝血时间的影响表明,该酶能够显著延长小鼠体内凝血时间,具有抗凝血作用。大鼠颈动脉血栓实验表明,UFEⅠ具有显著延长大鼠体内血栓形成时间的作用,并通过影响内源性凝血途径和血小板的聚集,及其较强的纤溶活力发挥抗凝作用,抑制血栓的形成。7.溶血性实验显示,UFEⅠ不引起机体出现任何溶血反应,不会造成机体出现出血倾向。8. UFEⅠ的免疫原性研究显示,该酶可使机体产生微量抗体,刺激动物体内启动体液免疫,提高机体的整体免疫水平,并表现出一过性,但对动物机能不造成负面影响,不属于毒素蛋白。综上所述,UFEⅠ具有显著的抗凝血和抗血栓形成作用,对动物机体无溶血、急性毒性和低免疫原性,因此,UFEⅠ具有潜在的应用开发价值。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1 血栓性疾病的研究现状
• 1.1 血栓性疾病类型及危害
• 1.2 血栓的形成机制
• 1.2.1 血液凝固的基本过程
• 1.2.2 凝血的级联反应
• 1.2.3 纤维蛋白的溶解
• 1.3 血栓性疾病治疗方法
• 1.4 血栓性疾病药物的研究进展
• 1.4.1 抗凝血药物
• 1.4.2 溶栓药物
• 1.4.3 抗血小板药物
• 1.5 海洋心血管药物的研究进展
• 1.5.1 研究现状
• 1.5.2 开发策略
• 1.5.3 展望
• 2 海洋无脊椎动物单环刺螠的相关研究
• 2.1 单环刺螠的生物学特性
• 2.2 开发应用情况
• 2.3 展望
• 3 立体依据及研究目标
• 3.1 立题依据
• 3.2 研究目标及内容
• 第二章 单环刺螠纤溶酶 UFEⅠ的酶学性质研究
• 2.1 材料，试剂和仪器
• 2.1.1 材料与试剂
• 2.1.2 仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 UFEⅠ的纯度鉴定和分子量测定
• 2.2.2 UFEⅠ的等电点（pI 值）测定
• 2.2.3 酶活力的测定
• 2.2.4 UFEⅠ的稳定性研究
• 2.2.5 温度对酶反应的影响
• 2.2.6 pH 对酶反应的影响
• 2.2.7 金属离子和抑制剂对酶活力的影响
• 2.2.8 酶的最适作用底物
• 2.2.9 酶的米氏常数（Km）和最大反应速度（Vmax）
• 2.2.10 UFEⅠ的总纤溶酶活力测定
• 2.3 实验结果
• 2.3.1 酶的纯度鉴定及分子量测定
• 2.3.2 UFEⅠ的等电点（pI 值）测定
• 2.3.3 酶的稳定性
• 2.3.4 温度对酶反应的影响
• 2.3.5 pH 对酶反应的影响
• 2.3.6 金属离子和抑制剂对酶活力的影响
• 2.3.7 酶的最适作用底物
• 2.3.8 酶的Km 和Vmax 值的确定
• 2.3.9 UFEⅠ的总纤溶酶活力测定
• 2.4 讨论
• 2.5 小结
• 第三章 单环刺螠纤溶酶 UFEⅠ的初步药效学研究
• 3.1 材料，试剂和仪器
• 3.1.1 材料与试剂
• 3.1.2 仪器
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 体外抗凝作用及凝血指标检测
• 3.2.2 体外溶栓实验
• 3.2.3 纤维蛋白原降解机理实验
• 3.2.4 小鼠血液凝固时间实验
• 3.2.5 大鼠体内血栓形成实验
• 3.2.6 统计学检验
• 3.3 实验结果
• 3.3.1 体外抗凝实验
• 3.3.2 体外溶栓实验
• 3.3.3 纤维蛋白原降解机制
• 3.3.4 小鼠血液凝固时间实验
• 3.3.5 大鼠体内血栓形成实验
• 3.4 讨论
• 3.5 小结
• 第四章 单环刺螠纤溶酶 UFEⅠ的安全性评价
• 4.1 材料，试剂和仪器
• 4.1.1 材料和试剂
• 4.1.2 仪器
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 体外溶血实验
• 4.2.2 UFEⅠ免疫原性的研究
• 4.3 实验结果
• 4.3.1 体外溶血实验
• 4.3.2 UFEⅠ免疫原性的分析
• 4.4 讨论
• 4.5 小结
• 总结
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历
• 发表的学术论文