SGK-1在ALI肺泡上皮差异性表达及对ENaC表达调控研究

论文摘要

目的以人肺腺癌细胞系A549细胞为对象研究胰岛素作用下肺泡上皮细胞钠离子通道α亚基（ENaC-α）表达的变化及其可能机制,并观察胰岛素作用下对A549细胞缺氧诱导的凋亡的影响。进一步通过脂多糖诱导的急性肺损伤模型研究胰岛素作用下实验动物血清炎症介质的变化、对肺干湿重比的影响,及对肺泡上皮细胞钠离子通道表达的调控及机制,了解胰岛素对炎症、肺水肿清除等方面的影响。方法细胞实验:以A549细胞为对象,用含30U/L的胰岛素培养基培养30 min和60 min,分别用蛋白免疫印迹法（Western blotting）和逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）法测定ENaC-α及血清和糖皮质激素诱导的蛋白激酶1（SGK-1）的蛋白及mRNA表达,并使用白屈菜红碱阻断蛋白激酶C（PKC）抑制SGK-1后再次测定ENaC-α蛋白表达。用原位末端缺刻标记法（TUNEL）测定经胰岛素处理后的A549细胞在缺氧条件下诱导凋亡,比较两组凋亡率变化。动物实验:72只成年健康SD大鼠随机分为3组,每组24只,经腹腔注射麻醉（戊巴比妥钠50mg/kg）（1）胰岛素治疗组（T组,24只）:大鼠麻醉后,经颈静脉插管按5mg/kg剂量注射LPS,两小时后微量泵泵入含0.5U/ml胰岛素的生理盐水溶液1ml/h,术中监测血糖,调节泵速使血糖在2.8-3.2mmol/l之间;（2）LPS模型组（L组,24只）:大鼠麻醉后,经颈静脉插管按5mg/kg剂量注射LPS,两小时后微量泵泵入生理盐水1ml/h;（3）对照组（C组,24只）:试验中单纯给予生理盐水,首次剂量1ml/kg,两小时后微量泵持续泵入生理盐水1ml/h。以首次注射后两小时为0点,分别于0,30分钟,1小时,2小时抽取静脉血后处死,取肺标本。采集血清,测TNF-α、IL-1β水平。取右肺称湿质量后,置70℃恒温烤箱中,烘烤72 h至其质量不再变化后测定肺脏干质量,计算肺湿/干重比右肺组织用于测量肺干湿重比,一部分左肺组织福尔马林固定,HE染色光镜下观察炎症反应情况及上皮细胞形态学改变,按病理变化评分,比较炎症及损伤程度。其余肺组织匀浆,用western-blot法检测肺组织中SGK-1表达的变化。采用荧光定量逆转录聚合酶链反应（RT-qPCR）法测定ENaC及血清和糖皮质激素诱导的蛋白激酶1（SGK-1）的mRNA,了解其转录水平。结果用胰岛素培养30 min即明显上调ENaC-α和SGK-1的蛋白和mRNA表达表达,并随处理时间延长表达量明显增加（P<0.05）。胰岛素还可以抑制缺氧诱导的A549细胞凋亡（10.3%比21.6%,P<0.05）。若以未添加胰岛素培养A549细胞蛋白表达量为100%,胰岛素作用30 min时ENaC-α、SGK-1蛋白表达量为124%、135%,60 min时ENaC-α、SGK-1蛋白表达量为186%、176%。胰岛素治疗后1小时组织病理学（4.30±1.6,5.10±1.9 P<0.05）、炎症指标（IL-1β26.27±6.67,31.5±7.78 P < 0.05 ; TNF-α243.1±54.65 , 291.71±63.56 P < 0.05 ; IL-8 ,451.53±41.19,538.29±45.14 P<0.05;PCT 570.96±46.88, 525.91±32.17 P<0.05）、肺湿/干重比（5.33±1.57,6.32±1.35 P<0.05）,有明显好转,两者比较有统计学差异。肺损伤模型建立后,ENaC和SGK-1与对照组比较,表达明显下降,两者比较有统计学差异（P<0.05）,经胰岛素治疗后SGK-1的蛋白表达增高,SGK-1与ENaC转录水平增高,与模型组比较两者有统计学意义（P<0.05）。结论在细胞实验中胰岛素可以通过PKC、SGK-1途径上调ENaC表达,并抑制缺氧诱导的A549细胞凋亡。在动物实验中加用胰岛素治疗可以抑制ALI/ARDS的炎症反应并通过上皮钠离子通道表达的增加,提高肺水肿清除能力,减轻肺水肿。因此我们认为胰岛素在ALI/ARDS病程中具有一定的保护和治疗作用。

论文目录

• 英汉缩略语名词对照
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分：体外实验
• 1 材料和方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 实验小结
• 参考文献
• 第二部分：体内试验
• 1 动物和材料
• 2 模型的制备
• 3 分组和给药
• 4 观察指标
• 5 统计学处理
• 6 结果
• 7 讨论
• 实验小结
• 参考文献
• 全文总结
• 文献综述
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文目录