万古霉素基因工程菌的前期研究

论文摘要

万古霉素是目前临床上用于治疗由甲氧西林耐药金葡菌(MRSA)引起的严重感染疾病的首选药物。20世纪80年代报道发现对万古霉素耐药的肠球菌以来,万古霉素耐药肠球菌的出现呈增长趋势,同时也引发了人们对甲氧西林耐药的金黄色葡萄球菌最终会产生对万古霉素耐药的担心。基于这种状况,开发治疗耐药菌所引起感染的新型糖肽类抗生素势在必行。随着对万古霉素等糖肽类抗生素生物合成的了解,利用糖基转移酶(Gtfs)催化合成新的杂合糖肽类抗生素,是目前一个研究比较活跃的领域;随着基因工程技术的飞速发展,在抗生素产生菌的育种中开始利用该技术来提高有效组分的含量,首要的任务是建立宿主菌的DNA转化系统。 本文作为新的万古霉素衍生物的初期研究,主要内容包括:万古霉素合成途径中糖基转移酶基因gtfD、gtfE的克隆与表达,万古霉素糖苷配基的制备,万古霉素产生菌的DNA转化系统建立和万古霉素产生菌的发酵调控。上述工作为万古霉素基因工程菌的构建与新型抗万古霉素耐药菌株的糖肽类抗生素的发酵生产提供了坚实的基础。 通过PCR的方法从质粒pLY24和pLY21上亚克隆了糖基转移酶基因gtfD、gtfE,克隆到大肠杆菌表达载体上。并且通过酸水解的方法获得了脱去一个糖基的万古霉素假糖苷,可以将其作为酶转化反应的底物,为进一步在宿主菌体外研究糖基转移酶的活性以及不同糖基的生理作用做好准备。 对东方拟无枝酸菌原生质体制备、再生及质粒DNA转化等条件进行了探索,考察了培养基组分、甘氨酸浓度、溶菌酶浓度等因素对原生质体的制备及其再生的影响。结果表明用含2%甘氨酸的TSB培养菌丝体,在28℃下经2 mg/ml溶菌酶处理1h,原生质体形成达3.18×10~7个/ml,原生质体再生率为3.1%。将带有安普霉素抗性基因的穿梭质粒,通过PEG介导转化东方拟无枝酸菌原生质体,PCR鉴定结果表明转化成功,为万古霉素基因工程菌的构建奠定了基础。 通过可溶性培养基中各组分对万古霉素合成影响的研究,以及发酵工艺条件的优化,获得了万古霉素发酵单位维持在1000μg/ml的培养基配方与培养条件,可用于基因工程菌的筛选。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略语（中英文全称）
• 第一章 文献综述
• 1.万古霉素研究概述
• 1.1 万古霉素发展概况
• 1.2 万古霉素的作用机理
• 1.3 万古霉素的耐药基因
• 1.4 万古霉素的生物合成机理
• 2.糖肽类抗生素的研究进展
• 2.1 糖肽类抗生素的结构与分类
• 2.2 糖肽类抗生素的半合成改造
• 2.3 半合成的糖肽类抗生素
• 2.4 糖肽类抗生素的生物合成
• 2.5 组合生物合成的应用
• 3.拟无枝酸菌基因工程初步探索
• 3.1 所用载体质粒
• 3.2 载体质粒的构建
• 3.3 外源基因的导入
• 4.立题依据
• 第二章 糖基转移酶基因表达载体的构建
• 1.实验材料
• 1.1 试剂
• 1.2 主要溶液和缓冲液
• 1.3 菌种和质粒
• 1.4 主要仪器和设备
• 2.实验方法
• 2.1 大肠埃希菌相关DNA克隆操作
• 2.2 糖基转移酶基因gtfD、gtfE的PCR扩增和克隆
• 2.3 IPTG诱导蛋白的表达
• 3.结果与讨论
• 3.1 通过PCR方法扩增gtfD、gtfE基因
• 3.2 gtfD、gtfE基因在pUC19上的亚克隆
• 3.3 表达质粒的构建
• 3.4 糖基转移酶基因gtfD、gtfE的诱导表达
• 4.本章小结
• 第三章 万古霉素糖苷配基的制备
• 1.实验材料
• 1.1 化学试剂
• 1.2 培养基
• 2.实验方法
• 2.1 水解反应
• 2.2 生物活性测定
• 2.3 水解物的制备
• 3.结果与讨论
• 3.1 酸水解液中组分的探索
• 3.2 碱水解液中组分的探索
• 3.3 万古霉素水解物的生物活性
• 4.本章小结
• 第四章 原生质体的制备、再生与转化
• 1.实验材料
• 1.1 主要生化试剂
• 1.2 培养基
• 1.3 主要溶液和缓冲液
• 1.4 菌种和质粒
• 1.5 主要仪器设备
• 2.实验方法
• 2.1 东方拟无枝酸菌原生质体的制备方法
• 2.2 大肠埃希菌相关DNA克隆操作
• 3.结果与讨论
• 3.1 原生质体制备和再生
• 3.2 东方拟无枝酸菌抗生素抗性标记的选择
• 3.3 PEG介导原生质体转化
• 4.本章小结
• 第五章 可溶性培养基的筛选
• 1.实验材料
• 1.1 菌种
• 1.2 主要试剂
• 1.3 培养基
• 1.4 主要仪器
• 2.实验方法
• 2.1 菌种培养和发酵
• 2.2 分析方法
• 2.3 发酵培养基的优化
• 3.结果与讨论
• 3.1 可溶性培养基的研究
• 3.2 摇瓶发酵工艺条件的优化
• 4.本章小结
• 全文总结
• 参考文献
• 致谢