利用胚性愈伤组织进行落叶松遗传转化体系的研究

论文摘要

落叶松（Larix ssp．）是重要的造林用材树种，由于落叶松无性繁殖困难、遗传操作难度大、育种周期长，传统育种技术远远不能满足现代遗传改良的要求，因此，建立稳定高效的落叶松遗传转化体系，进行基因工程育种，将会解决许多用经典遗传育种方法难以解决或解决不了的问题，具有重要的科学意义。本研究利用落叶松体细胞胚胎发生与再生体系，以不同落叶松胚性细胞系为受体，进行落叶松遗传转化试验，旨在对落叶松遗传转化效率的主要影响因子进行探索研究，以提高落叶松遗传转化率。结果如下：（1）建立了农杆菌介导的稳定的遗传转化体系，对影响农杆菌介导落叶松胚性细胞转化效率的主要因子进行优化，结果表明：胚性愈伤组织在高渗培养基Pre(BA 0.8 mg·L-1，肌醇9 g·L-1)上继代3次（每次14 d）以上，然后预培养7～10 d最适宜作为转化受体；与其它因素相比，AS、CA等诱导物对农杆菌转化效率的影响更为关键，侵染液中和共培养基中添加100μM乙酰丁香酮（AS）或100μM松柏醇（CA）对落叶松胚性愈伤组织的转化存在一定的诱导效应，但以同时添加两种诱导物50μM AS和50μM CA时效果最好，侵染液中添加表面活性剂0.1％Tween-20能明显提高转化效率；菌液浓度OD600为0.4、侵染时间为20 min、共培养3d有利于提高T-DNA转移效率，而且不会出现农杆菌过度增殖毒害转化愈伤组织的现象。（2）用抗生素进行脱菌培养时，不同落叶松胚性细胞系对羧苄青霉素（Carb）的耐受性差异较大，脱菌洗涤后转移至无选择压的培养基上恢复培养7d，脱菌过程中逐渐降低Carb的使用浓度，减少筛选次数（筛选2次），可明显降低抗生素对胚性细胞增殖和体细胞胚诱导及分化的抑制。（3）运用本实验建立的农杆菌介导落叶松遗传转化优化体系转化不同落叶松胚性细胞系，效果稳定，抗性愈伤率约为10％～15％，分子检测结果表明获得42株转基因植株。与基因枪法相比，农杆菌介导法转化效果稳定，更适合应用于落叶松胚性细胞的转化。（4）基因枪法转化落叶松胚性愈伤组织时，真空度26 cmHg，阻挡网至靶细胞距离为6 cm，轰击2次时抗性愈伤组织产率明显高于其它梯度水平的组合，但基因枪法转化后的胚性愈伤组织在随后的筛选过程中抗性愈伤组织产率不稳定，转化植株分子检测表明外源基因未整合到植物基因组中。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 目录
• 第一章 绪论
• 1.1 引言
• 1.1.1 研究背景
• 1.1.2 项目来源与经费支持
• 1.2 针叶树遗传转化研究进展
• 1.2.1 农杆菌介导针叶树的遗传转化
• 1.2.1.1 菌株类型
• 1.2.1.2 最佳受体材料的选择
• 1.2.1.3 促进 Vir 基因的活化
• 1.2.1.4 菌液浓度和侵染时间
• 1.2.2 基因枪介导针叶树的遗传转化
• 1.2.3 其它方法
• 1.2.4 报告基因
• 1.2.4.1 β-葡萄糖苷酸酶（GUS）基因
• 1.2.4.2 NPT-II 基因
• 1.2.4.3 绿色荧光蛋白基因
• 1.2.5 转基因植株的鉴定及外源基因的表达
• 1.2.5.1 PCR 检测
• 1.2.5.2 Southern 杂交
• 1.2.5.3 PCR-Southern 杂交
• 1.2.6 外源基因的遗传、表达与调控
• 1.2.6.1 插入位点数和拷贝数
• 1.2.6.2 增强外源基因的表达
• 1.2.6.3 转基因沉默及其克服策略
• 1.2.6.4 外源基因在转基因后代中的遗传
• 1.3 落叶松遗传转化研究现状与展望
• 1.4 甜菜碱与植物抗逆
• 1.4.1 甜菜碱生物合成的相关基因
• 1.4.1.1 胆碱单加氧酶基因
• 1.4.1.2 甜菜碱醛脱氢酶基因
• 1.5 研究思路
• 第二章 农杆菌介导落叶松遗传转化体系的建立
• 2.1 实验材料与方法
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.1.1 植物材料
• 2.1.1.2 菌株和质粒
• 2.1.1.3 培养基
• 2.1.1.4 试剂和设备
• 2.1.2 方法
• 2.1.2.1 菌株培养
• 2.1.2.2 抗生素使用种类和浓度的确定
• 2.1.2.3 转化方法和步骤
• 2.1.2.4 转化体的筛选与植株再生
• 2.1.2.5 转化植株的分子检测
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 选择压对胚性愈伤组织生长的影响
• 2.2.2 工程菌液的制备
• 2.2.3 脱菌抗生素种类和浓度的确定
• 2.2.4 预处理对转化效果的影响
• 2.2.5 预培养时间对转化效果的影响
• 2.2.6 农杆菌菌液浓度和侵染时间对转化效果的影响
• 2.2.7 共培养时间对转化效果的影响
• 2.2.8 诱导物 AS 和 CA 对转化效果的影响
• 2.2.9 表面活性剂 Tween-20 对转化效果的影响
• 2.2.10 脱菌方式对抗性愈伤组织形成与分化的影响
• 2.2.11 不同细胞系的转化效果
• 2.2.12 转化植株的 PCR 检测
• 2.2.13 转化植株的 Southern 检测
• 2.3 小节
• 第三章 基因枪介导落叶松遗传转化体系的建立
• 3.1 实验材料与方法
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.1.1 植物材料
• 3.1.1.2 质粒
• 3.1.1.3 培养基
• 3.1.1.4 试剂和耗材
• 3.1.2 方法
• 3.1.2.1 质粒 DNA 的提取与纯化
• 3.1.2.2 基因枪转化
• 3.1.2.3 转化体的筛选与植株再生
• 3.1.2.4 转化植株的分子检测
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 基因枪转化时轰击参数的确定
• 3.2.2 转化植株的分子检测
• 3.3 小节
• 第四章 讨论
• 4.1 农杆菌介导落叶松胚性愈伤组织的遗传转化
• 4.1.1 抗生素对转化效率的影响
• 4.1.2 胚性愈伤组织生理状态对转化效率的影响
• 4.1.3 诱导物 AS 和 CA 对转化效率的影响
• 4.1.4 农杆菌接种强度对转化效率的影响
• 4.2 基因枪介导落叶松胚性愈伤组织的遗传转化
• 第五章 论文结论
• 参考文献
• 图版
• 附录
• 致谢