化学修饰对适冷蛋白酶MCP-01结构和功能的影响以及MCP-01自溶机制的研究

论文摘要

本论文以假交替单胞菌Pseudoalteromonas sp.SM9913所产适冷蛋白酶MCP-01为研究对象，研究包括氨基酸序列分析、酶的自溶机制以及化学修饰对酶结构和功能的影响。 通过对MCP-01氨基酸序列的比对，发现MCP-01与protease K subfamily中的两条序列同源性最高（42％），且含有该subfamily的保守序列，因此将MCP-01归于此subfamily。氨基酸组成的研究中，发现MCP-01的催化结构域和整个成熟酶都含有适冷酶的普遍特征：较高的酸性氨基酸、Gly含量，较低的碱性氨基酸、Pro、Arg含量、A-index值。分别以1DBI和1R64（PDB编号）为模版，对催化结构域和PKD结构域进行了三维模型构建：催化结构域的三维结构主要由α-螺旋和β-折叠组成，存在一个有α-螺旋和β-折叠围成的催化腔，参与催化的Ser、Asp、His存在于催化腔的底部；PKD结构域则主要由β-折叠，几乎不含α-螺旋和其他二级结构。 在MCP-01自溶机制的研究中，我们探索了高T值SDS-PAGE和Tricine-SDS-PAGE体系对MCP-01自溶片断的分辨能力。同时通过sigmascan对0.2mg／ml的MCP-01在35℃、50mM pH 7.5的tris-HCl缓冲体系中自溶速度的分析，判断MCP-01酶分子的降解是一级反应，说明酶分子与自溶片断之间没有相互降解作用。然后通过对自溶条带N端序列的测定，得到M1-M4的N端和MCP-01的完全同，说明该酶的自溶是从C端开始的；通过分析M5-M8的N端序列，得到4个自溶位点，全部位于催化结构域：Thr38位于S8结构域的N端，Ala63、Ala91、Ala203位于无规则蜷曲区域中。 采用还原胺化、高碘酸盐氧化、戊二醛交联、EDC交联的方法，主要选取部分单糖和二糖为修饰试剂，对产物酶的热稳定性进行测定，发现0.1％戊二醛处理产物的稳定性略高于对照。于是选取戊二醛-葡糖胺的方法对MCP-01进行修饰，对修饰酶和对照的最适酶活温度、酶促反应动力学、热失活动力学、紫外吸收光谱、内源荧光光谱、Far-UV CD光谱、热变性动力学进行了分析。修饰酶的热失活半衰期t1／2、热变性熔化温度Tm、变构自由能△G#都高于对照，反映出戊二醛-葡糖胺修饰酶的热稳定性有一定幅度的提高。根据热变性的△Hm（修饰酶＞对照）以及CD光谱的

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 研究背景
• 1.1 海洋细菌适冷酶研究进展
• 1.1.1 适冷酶的定义
• 1.1.2 适冷酶的种类及来源
• 1.1.3 适冷酶的适冷催化特征
• 1.1.4 适冷酶的结构特征
• 1.2 酶化学修饰的研究进展
• 1.2.1 酶化学修饰的目的
• 1.2.2 酶的侧链基团的修饰
• 1.2.3 用于化学修饰的试剂
• 1.2.4 修饰后酶性质的变化
• 1.3 立题依据
• 1.4 相关研究基础
• 第二章 适冷蛋白酶MCP-01序列分析及三维结构模拟
• 2.1 材料和软件
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 实验软件
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 MCP-01的氨基酸序列分析
• 2.2.2 序列同源性比对和进化树分析
• 2.2.3 MCP-01二级结构预测及分析
• 2.2.4 MCP-01三级结构模型的构建
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 MCP-01的氨基酸序列分析
• 2.3.2 MCP-01在subtilase家族中的分类
• 2.3.3 MCP-01与同源中温酶一级序列的比较
• 2.3.4 MCP-01二级结构预测
• 2.3.5 MCP-01三维结构模型的构建
• 2.3.6 MCP-01三级结构模型中化学修饰相关氨基酸的分布
• 2.4 讨论
• 第三章 MCP-01自溶机制的研究
• 3.1 试剂与仪器
• 3.1.1 试剂
• 3.1.2 仪器
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 常规SDS-PAGE
• 3.2.2 MCP-01自溶速度的分析
• 3.2.3 Tricine-SDS-PAGE系统
• 3.2.4 自溶片断的转膜电泳和N端测序
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 自溶片断的电泳分析
• 3.3.1.1 普通低T值SDS-PAGE的对MCP-01自溶片段的分离
• 3.3.1.2 普通高T值SDS-PAGE的对MCP-01自溶片段的分离
• 3.3.1.3 Tricine-SDS-PAGE系统对MCP-01自溶片段的分离
• 3.3.2 自溶位点的测定
• 3.4 讨论：
• 第四章 适冷蛋白酶MCP—01化学修饰方法的筛选
• 4.1 试剂与仪器
• 4.1.1 蛋白酶
• 4.1.2 试剂
• 4.1.3 仪器
• 4.2 试验方法
• 4.2.1 蛋白酶的纯化
• 4.2.2 酶活测定：
• 4.2.3 MCP-01表面氨基修饰
• 4.2.3.1 还原胺化法
• 4.2.3.2 CMC的高碘酸盐氧化法：
• 4.2.3.3 寡糖的高碘酸盐氧化法
• 4.2.3.4 戊二醛交联法（对氨基苯甲酸为修饰剂）
• 4.2.4 热稳定性测定
• 4.3 结果及分析
• 4.3.1 葡萄糖的还原胺化修饰
• 4.3.2 纤维二糖的还原胺化修饰
• 4.3.3 高碘酸盐氧化修饰
• 4.3.4 戊二醛交联修饰
• 4.3.5 MCP-01表面羧基的修饰—EDC法
• 4.4 讨论
• 第五章 戊二醛-葡萄糖胺修饰对MCP-01结构和功能的影响
• 5.1 材料和方法
• 5.1.1 试验材料
• 5.1.2 试验方法
• 5.2 结果和分析
• 5.2.1 最适pH和最适酶活温度
• 5.2.2 修饰前后MCP-01酶动力学特征的变化
• 5.2.3 酶的热失活动力学
• 5.2.4 修饰前后MCP-01紫外吸收光谱的变化
• 5.2.5 修饰前后MCP-01蛋白内源荧光光谱的变化
• 5.2.6 修饰前后CD光谱反映出的MCP-01二级结构的变化
• 5.2.7 酶结构的热变性动力学（以220nm CD光谱为表征）
• 5.3 讨论：
• 参考文献
• 致谢