水稻穗形态建成基因PMM1的分离克隆

论文摘要

稻穗是水稻种子着生的器官,稻穗形态建成是水稻产量的决定因素之一,因此研究水稻穗的发育无论在发育生物学还是在育种上都具有重要的理论意义和实际应用价值。本研究从水稻粳稻品种“中花11号”T-DNA插入突变体库中鉴定了5个穗形态突变体,它们均表现为植株半矮、叶夹角变小、一次枝梗轮生、复粒稻、粒长变短、粒宽变宽等突变表型。通过遗传分析和基因定位,获得了控制水稻穗形态建成的预测候选基因,并分离克隆该基因进行了遗传互补实验以验证基因的功能。采用电子显微镜等细胞学分析和基因表达原位杂交等实验来分析该基因在幼穗发育过程的作用。该基因的分离克隆及功能分析,将更好地揭示水稻穗形态建成的分子机理,并对水稻产量性状的遗传改良奠定重要的分子基础。本研究的主要结果如下：1.5个纯合突变体与珍汕97配置5个杂交组合,对杂交后代的遗传分析表明这5个突变体的突变性状都是受一对隐性基因（Panicle Morphological Mutant 1, PMM1）控制。采用图位克隆的方法,将该基因定位在第4染色体长臂上的RM3866-1和X4（InDel）两标记之间,其两侧物理图距为147kb左右。基因双突变杂交F1代表型考察证明pmm1-1.pmm1-2和pmm1-3这3个突变体为等位突变体。预测PMM1基因为一个细胞色素P450基因,基因号为LOCOs04g39430.并且pmm1-1突变体在该基因发生了大片段的缺失。2.暗形态分析显示,黑暗条件下对照CK处理时,突变体pmm1-1的胚芽鞘平均长度只是野生型ZH11的63.7%,pmm1-1的中胚轴都没有生长,而ZH11的中胚轴生长了53.3%；随着BR处理浓度的提高,突变体pmm1-1胚芽鞘几乎与野生型ZH11一样长。在BR-10-6mol/L浓度处理时野生型ZH11所有材料都长出了中胚轴,并且pmm1-1的中胚轴的出现率恢复到了63.3%。3.半定量RT-PCR实验结果显示,孕穗期时野生型植株中,PMM1基因在根、茎、叶、叶鞘和穗中都有不同程度的表达,在穗中表达量相对要高很多,而该基因在pmm1-1突变体中几乎检测不到表达。4.原位杂交实验结果显示,野生型的幼穗中有很强的杂交信号,特别是在枝梗和小穗原基上,在幼叶中也有微量的杂交信号,但是在pmm1-1突变体中几乎都没有检测到杂交信号。5.电镜扫描实验结果显示,pmm1-1突变体与野生型在穗原基形成期、一次枝梗原基形成期以及二次枝梗原基形成期都没有发现差异,只有在小穗原基以及花原基形成期有差异,在这一时期突变体明显有复粒表型性状出现,并且每个小穗的花原基都是完整且正常的,和一花多子房的复粒稻是不一样的。6.构建了PMM1基因的互补载体pC2301-PMM1-25N18和pC2301-PMM1-16002,农杆菌介导转化突变体pmm1-1的愈伤。转化苗已生根培养,后续工作还在进行。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 缩写名词表
• 1 前言
• 1.1 研究问题的由来
• 1.2 文献综述
• 1.2.1 水稻穗型的研究进展
• 1.2.1.1 水稻穗的发育过程
• 1.2.1.2 水稻穗部的遗传发育研究
• 1.2.1.2.1 水稻直立穗的研究进展
• 1.2.1.2.2 水稻长短穗的研究进展
• 1.2.1.2.3 水稻密集型穗的研究进展
• 1.2.1.2.4 水稻稀疏型穗的研究进展
• 1.2.1.2.5 水稻簇生穗的研究进展
• 1.2.2 油菜素内酯类（Brassinosteroids,BRs）的研究进展
• 1.2.2.1 BR的生物合成途径
• 1.2.2.2 BR合成途径的相关突变体研究
• 1.2.2.3 BR与水稻产量的关系
• 1.2.2.4 BR与生长素（IAA）之间的相互关系
• 1.3 研究目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 菌株、载体和质粒
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 水稻材料的田间种植
• 2.2.2 植株的DNA抽提
• 2.2.3 基因的T-DNA插入标签检测
• 2.2.4 基因定位的分子标记分析
• 2.2.5 基因定位群体的构建及定位方法
• 2.2.6 候选基因预测
• 2.2.7 等位性分析
• 2.2.8 石蜡切片
• 2.2.9 振动切片
• 2.2.10 电镜扫描
• 2.2.11 RNA的抽提及表达分析
• 2.2.12 原位杂交
• 2.2.13 BR（brassinosteroid,油菜素内酯）的生理分析
• 2.2.13.1 黑暗条件下的表型观察
• 2.2.13.2 叶面喷施BR实验
• 2.2.14 功能互补实验
• 3 结果与分析
• 3.1 水稻穗形态建成突变体的鉴定
• 3.2 用于基因定位的杂交组合配制和遗传分析
• 3.3 基因PMM1的初步定位
• 3.3.1 多态性遗传标记的开发
• 3.3.2 基因PMM1的初步定位
• 3.4 候选基因的预测
• 3.5 BR（brassinosteroid,油菜素内酯）的生理分析
• 3.5.1 暗条件下植株的生长
• 3.5.2 叶面喷施BR实验
• 3.6 PMM1基因表达分析
• 3.7 pmm1-1突变体幼穗发育的细胞学考察
• 3.7.1 电镜扫描分析
• 3.7.2 振动切片和石蜡切片分析
• 3.8 pmm1-1突变体的功能互补实验
• 4 讨论
• 4.1 PMM1基因编码一个细胞色素P450蛋白
• 4.2 pmm1-1是一个BR缺失突变体
• 4.3 突变体pmm1-1与d11的异同
• 4.4 PMM1基因克隆的意义
• 参考文献
• 致谢
• 个人简介