莱克多巴胺杂交瘤细胞株的建立及其金标快速检测试纸的研制

论文摘要

莱克多巴胺（Ractopamine,RAC）与克仑特罗（Clenbutero1,CL）都是β2-激动剂类违禁药物。RAC具有广泛的生理效应,常被用于支气管哮喘、支气管痉挛和产科疾病的治疗。动物日粮中添加RAC能显著提高胴体瘦肉率和饲料报酬,但是长期使用会在动物体内残留,通过食物链导致人体中毒,表现为心悸、肌肉震颤、恶心呕吐、头昏、神经过敏和外周血管扩张,甚至引起死亡。另外,β2-激动剂还有致癌、致畸、致突变作用。随着CL等药物被禁用,RAC的非法添加日趋严重。RAC的检测方法较CL等其他β2-激动剂滞后,不能满足现场和快速检测的要求。因此建立一种能够快速高效、灵敏经济的RAC残留检测方法迫在眉睫。本研究利用蛋白质连接技术人工合成了完全抗原,通过杂交瘤技术制备了抗RAC单克隆抗体,并利用胶体金免疫层析技术,采用竞争法成功研制了RAC胶体金免疫层析试纸,试纸灵敏度、特异性、稳定性等均达到检测要求,其规模化筛选特点更适用于常规化检测需要,具有重要的现实意义和极高的商业开发价值。1.人工抗原的合成与抗RAC单克隆抗体的制备以多元酸酐与混合酸酐联用法将半抗原RAC分别与载体牛血清白蛋白（BSA）和卵清白蛋白（OVA）偶联制成人工抗原,以RAC-BSA免疫BALB/c小鼠,以RAC-OVA作为ELISA包被抗原,应用杂交瘤单克隆化技术获得1株能稳定分泌抗RAC单克隆抗体的杂交瘤细胞株G11;用间接ELISA方法测定腹水单抗效价为1:409600;经胶体金免疫层析实验（GICA）鉴定单抗与RAC特异性结合;G11单抗对RAC的半数抑制浓度（IC50）为2.75ng·ml-1,除与多巴酚丁胺有9.8%的交叉反应外,与克伦特罗、肾上腺素、去甲肾上腺素、异丙肾上腺素、苯氧丙酚胺、沙丁胺醇和多巴胺的交叉反应性都小于0.03%;该细胞株体外多次传代培养和反复冻存复苏后抗体分泌稳定。2.胶体金及RAC胶体金免疫层析试纸的制备采用柠檬酸三钠还原法制备直径20nm左右的胶体金并标记单抗作为检测试剂,单抗加入量为7.2μg·ml-1,标记pH控制在8.2左右,以1% PEG20000作稳定剂。采用国产上海金标SB-06玻璃纤维膜作为金标抗体吸附材料,Sartorius CN-140硝酸纤维素膜作为层析材料制成试纸。抗原和二抗包被浓度分别为1mg·ml-1(1μl·cm-1)、2mg·ml-1(1μl·cm-1),金标单抗按1:3稀释后喷布于玻璃纤维膜上,1ml/垫（50mm×60mm）。胶体金免疫层析试纸条的检测灵敏度为5ng·ml-1,在室温干燥条件下可保存12个月以上。本实验研制的胶体金免疫层析试纸条最大的优点是无需借助检测仪器,检测所需试剂已包被在试纸条上,检测快速、特异、灵敏、简便,10min内可出检测结果,适用于对RAC残留进行现场检测。本研究也为其他兽药残留检测胶体金试纸的研制提供了借鉴。

论文目录

• 致谢
• 中文摘要
• 文献综述
• 1 兽药残留与食品安全
• 2 胶体金免疫层析技术现状及其应用
• 实验一 莱克多巴胺人工抗原的合成与鉴定
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 小结
• 实验二 莱克多巴胺单克隆抗体的制备与鉴定
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 小结
• 实验三 莱克多巴胺金标免疫层析试纸条的制备
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 小结
• 全文总结
• 参考文献
• 英文摘要
• 附录