中国明对虾（Fenneropenaeus chinensis）卵黄蛋白的生化性质及基因克隆

论文摘要

卵黄蛋白（Vitellin, Vn）是卵黄的主要成分,在雌性对虾性腺成熟过程中合成,为胚胎和幼体早期发育提供营养。本文对中国明对虾卵黄蛋白及其前体卵黄蛋白原（Vitellogenin, Vg）的生化特征进行了研究,并克隆了Vg的全长cDNA序列。利用凝胶过滤（SephadexG-150）、离子交换（DEAE-Cellulose-32）以及电洗脱等方法纯化了中国明对虾Vn和Vg。Vn是一种糖脂磷类胡萝卜素蛋白,总分子量409 ku,等电点5.4,含糖量8.7%,具有5个亚基（202 ku、171 ku、105ku、80 ku和73 ku）,亚基之间有1个二硫键。Vg也是一种糖脂磷类胡萝卜素蛋白,总分子量476 ku,等电点5.2,含糖量11.6%,亚基之间未发现二硫键。利用纯化的Vn免疫家兔制备抗血清。此抗血清能与对虾属内不同个体Vn或Vg发生免疫反应,但与属外个体间无此特性。免疫组织学观察证明对虾外源性Vg产生于肝胰腺,经血淋巴、滤泡细胞的转运,最终被卵母细胞吸收,加工成Vn。采用ELISA方法检测了对虾卵及无节幼体对Vn的利用过程。卵子排出后卵及幼体体内卵黄蛋白含量不断减少,N3-4至N5-6期和N5-6至Z1期两个时期Vn的消耗量最大,分别为1322 ng／mL和1213 ng／mL,占卵中卵黄蛋白总量的38.9%和35.7%,Z1期以后体内基本不含卵黄蛋白。通过同源克隆和RACE等方法从成熟中国明对虾卵巢中克隆到了一条VgcDNA序列。全长7956 bp,含有一个7761 bp的开放阅读框（ORF）,编码2587个氨基酸残基。推导的氨基酸序列与其他已知甲壳动物Vg具有80-95%的同一性（identity）。其中,中国明对虾和墨吉明对虾Vg分子的亲缘关系最近。SingalP程序预测Vg前体N末端含有18个氨基酸残基的信号肽。其余2569个氨基酸中含有一个RXRR分裂位点,此位点能被枯草杆菌样蛋白内切酶（subtilisin-like endoproteases）所识别并裂解。推导的Vg的理论分子量是282 ku,理论等电点为6.13。氨基酸含量分析显示,Vg蛋白含有较多的Ala（11.56%）、Glu（8.99%）、Val（8.52%）和Ile（7.12%）。RT-PCR方法检测到Vg基因同时存在于雌性和雄性对虾基因组中,但其转录只发生在卵黄形成期的雌性对虾的卵巢和肝胰腺中。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
• 1.1 研究目的
• 1.2 研究意义
• 1.3 研究进展
• 1.3.1 卵黄蛋白和卵黄蛋白原的性质研究进展
• 1.3.2 卵黄蛋白及卵黄蛋白原的产生部位
• 1.3.2.1 卵巢
• 1.3.2.2 肝胰腺
• 1.3.2.3 脂肪体
• 1.3.2.4 双重来源
• 1.3.3 卵黄蛋白与卵黄蛋白原的营养价值
• 1.3.3.1 营养价值
• 1.3.3.2 生理功能
• 1.3.4 卵黄蛋白免疫学研究
• 1.3.5 卵黄蛋白原基因分子克隆的研究进展
• 1.3.5.1 昆虫卵黄蛋白原基因克隆的研究进展
• 1.3.5.2 脊椎动物Vg基因研究进展
• 1.3.5.3 甲壳动物卵黄蛋白原基因分子克隆的研究进展
• 1.3.5.4 甲壳动物卵黄蛋白原基因的表达研究进展
• 第2章 中国明对虾卵黄蛋白及卵黄蛋白原的纯化
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 材料
• 2.2.2 仪器
• 2.2.3 方法
• 2.2.3.1 样品的制备
• 2.2.3.2 卵黄蛋白的鉴定
• 2.2.3.3 色谱法纯化卵黄蛋白
• 2.2.3.4 选择沉淀法和电洗脱法纯化卵黄蛋白
• 2.2.3.5 卵黄蛋白抗体的制备
• 2.2.3.6 中国明对虾血淋巴中卵黄蛋白原的鉴定
• 2.2.3.7 卵黄蛋白原的纯化
• 2.3 结果
• 2.3.1 卵黄蛋白的鉴定
• 2.3.1.1 对比电泳结果
• 2.3.1.2 脂蛋白染色
• 2.3.2 卵黄蛋白的提纯
• 2.3.2.1 凝胶过滤层析结果
• 2.3.2.2 离子交换柱层析结果
• 2.3.2.3 选择沉淀电泳结果
• 2.3.2.4 电洗脱结果
• 2.3.3 中国明对虾血淋巴中卵黄蛋白原的鉴定
• 2.3.3.1 免疫双扩散结果
• 2.3.3.2 对比电泳结果
• 2.3.4 卵黄蛋白原的提纯
• 2.3.4.1 卵黄蛋白原的阴离子交换柱层析纯化
• 2.3.4.2 卵黄蛋白原的选择沉淀纯化
• 2.3.4.3 卵黄蛋白原的电洗脱结果
• 2.4 讨论
• 第3章 中国明对虾卵黄蛋白原与卵黄蛋白的部分生化性质
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 材料
• 3.2.2 仪器
• 3.2.3 方法
• 3.2.3.1 糖蛋白染色
• 3.2.3.2 脂蛋白的染色
• 3.2.3.3 磷蛋白染色
• 3.2.3.4 总分子量测定
• 3.2.3.5 亚基数目以及分子量的测定
• 3.2.3.6 类胡萝卜素辅基检测
• 3.2.3.7 糖含量的测定
• 3.2.3.8 二硫键数目的测定
• 3.2.3.9 等电点的测定
• 3.2.3.10 卵黄蛋白原热稳定性检测
• 3.3 结果
• 3.3.1 糖蛋白染色
• 3.3.2 脂蛋白染色
• 3.3.3 磷蛋白染色
• 3.3.4 总分子量测定
• 3.3.5 亚基数目及分子量
• 3.3.6 类胡萝卜素检测
• 3.3.7 糖含量的测定
• 3.3.8 等电点测定
• 3.3.9 二硫键数目的测定
• 3.3.10 卵黄蛋白原热稳定性检测
• 3.4 讨论
• 第4章 中国明对虾雌性蛋白在部分组织中的免疫观察
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 材料
• 4.2.2 仪器
• 4.2.3 方法
• 4.2.3.1 免疫扩散法在对虾体内检测雌性蛋白
• 4.2.3.2 常规组织观察
• 4.2.3.3 免疫组织学观察（间接荧光免疫）
• 4.3 结果
• 4.3.1 免疫扩散法在对虾体内检测雌性蛋白
• 4.3.2 不同物种的种间免疫扩散反应
• 4.3.3 免疫组织学观察
• 4.4 讨论
• 第5章 中国明对虾幼体发育过程中卵黄蛋白含量的变化
• 5.1 引言
• 5.2 材料和方法
• 5.2.1 实验材料
• 5.2.2 实验仪器及试剂
• 5.2.3 实验方法
• 5.2.3.1 样品的制备
• 5.2.3.2 样品中Vn含量的ELISA检测
• 5.3 结果
• 5.4 讨论
• 5.4.1 VN在中国明对虾幼体发育时期的变化情况
• 5.4.2 VN对中国明对虾幼体生长的影响
• 5.4.3 VN的幼体饵料研究
• 第6章 中国明对虾卵黄蛋白原CDNA的克隆和序列分析
• 6.1 引言
• 6.2 材料与方法
• 6.2.1 材料
• 6.2.2 仪器与试剂
• 6.2.3 方法
• 6.2.3.1 引物设计
• 6.2.3.2 卵黄蛋白原cDNA中间片段的克隆
• 6.2.3.3 卵黄蛋白原CDNA3'-RACE和5'-RACE
• 6.2.3.4 序列分析
• 6.3 结果
• 6.3.1 卵巢总RNA的提取
• 6.3.2 卵黄蛋白原CDNA中间片段扩增结果
• 6.3.3 卵黄蛋白原CDNA 3'-RACE和5'-RACE
• 6.3.4 中国明对虾卵黄蛋白原CDNA全序列及分析
• 6.3.5 九种虾类基于VG氨基酸序列的系统发生分析
• 6.4 讨论
• 第7章 中国明对虾卵黄蛋白原基因表达特征的初步研究
• 7.1 引言
• 7.2 卵黄蛋白原基因表达特征的研究
• 7.2.1 材料
• 7.2.2 仪器与试剂
• 7.2.3 方法
• 7.2.3.1 引物设计
• 7.2.3.2 中国明对虾雌雄肌肉基因组DNA的提取
• 7.2.3.3 PCR扩增雌雄虾的卵黄蛋白原基因片段
• 7.2.3.4 中国明对虾成熟雌虾各组织总RNA的提取
• 7.2.3.5 RT-PCR
• 7.3 结果
• 7.4 讨论
• 参考文献
• 研究成果
• 致谢