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弧菌三联融合毒素基因表达及ELISA检测方法的建立

2020-12-03阅读(566)

弧菌三联融合毒素基因表达及ELISA检测方法的建立

论文摘要

本实验以三种食物中毒性弧菌的毒素,即副溶血弧菌的耐热型直接溶血素（Vibrio parahaemolyticus TDH）、创伤弧菌的溶细胞毒素（Vibrio vulnificus cytolysin）和拟态弧菌的热不稳定型溶血素（Vibrio mimicus heat-labile hemolysin）的基因为研究对象,根据GenBank上已发表的基因序列设计PCR引物,成功克隆出三个编码成熟毒素蛋白的基因片段,即tdh、vvhA和vmhA。采用柔性Linker序列（Gly4Ser）,通过重叠延伸PCR方法逐步串联三个毒素基因（tdh-vvhA-vmhA）,最终获得三联融合毒素基因（3225bp）,命名为FT。将FT克隆到原核表达载体pET-22b（+）中,构建了重组表达载体22b-FT,并在表达宿主菌E. coli BL21（DE3）中得到有效表达,表达的融合毒素蛋白大小为120.4KDa。当IPTG的终浓度为1mmol/L,37℃诱导4h时表达量最高,为11.49%,表达的蛋白主要以包涵体形式存在。而25℃诱导过夜,融合毒素蛋白几乎全部是可溶性的。将此融合毒素蛋白包涵体纯化,免疫豚鼠制备血清抗体,确定间接ELISA的最佳工作条件,建立了食物中毒性弧菌间接ELISA检测方法,并进行敏感性、特异性及样品模拟试验。结果表明此方法具有广谱性强、灵敏度高、特异性好、快速简便的优点,为食品中多种弧菌的检测提供了一种广谱、快速、同步的新方法,为食物中毒性弧菌快速检测试剂盒的研制奠定了基础。

论文目录

  • 内容提要
  • 引言
  • 第一篇 文献综述
  • 第一章 弧菌的致病性及毒力基因的研究进展
  • 第二章 弧菌快速检测方法的研究进展
  • 第二篇 研究内容
  • 第一章 食物中毒性弧菌毒素基因片段的克隆
  • 1 材料与方法
  • 1.1 材料
  • 1.1.1 菌株
  • 1.1.2 培养基
  • 1.1.3 工具酶与试剂
  • 1.1.4 其他试剂
  • 1.1.5 仪器
  • 1.2 方法
  • 1.2.1 弧菌的复苏与培养
  • 1.2.2 基因组DNA 的提取
  • 1.2.3 目的基因的扩增
  • 1.2.4 PCR 扩增产物的回收
  • 1.2.5 目的基因的克隆
  • 1.2.6 重组质粒的序列测定和序列分析
  • 2 结果
  • 2.1 弧菌的复苏和培养
  • 2.2 目的基因的扩增
  • 2.3 目的基因的克隆
  • 2.4 重组质粒的序列测定和序列分析
  • 3 讨论
  • 3.1 基因组DNA 克隆方法的选择与确定
  • 3.2 三个毒素基因片段的PCR 扩增
  • 3.3 三个毒素基因片段重组质粒的序列测定和序列分析
  • 4 小结
  • 第二章 三个毒素基因的串联、表达载体构建及表达
  • 1 材料与方法
  • 1.1 材料
  • 1.1.1 质粒和菌株
  • 1.1.2 工具酶与试剂盒
  • 1.1.3 试剂
  • 1.1.4 仪器
  • 1.2 方法
  • 1.2.1 三个毒素基因片段的串联
  • 1.2.2 FT 重组表达载体的构建
  • 1.2.3 FT 的诱导表达
  • 2 结果
  • 2.1 三个毒素基因片段的串联
  • 2.1.1 三个毒素基因片段的PCR 扩增与串联
  • 2.1.2 三联融合毒素基因FT 的克隆
  • 2.1.3 重组质粒pMD-18T-FT 的序列测定和序列分析
  • 2.2 FT 重组表达载体的构建
  • 2.3 FT 的诱导表达
  • 2.3.1 FT 的诱导表达及表达条件的优化
  • 2.3.2 融合毒素蛋白表达量的测定
  • 2.3.3 表达形式的鉴定
  • 3 讨论
  • 3.1 引物中Linker 的设计
  • 3.2 重叠延伸PCR 扩增方法
  • 3.3 FT 的诱导表达
  • 3.3.1 宿主-载体系统的选择
  • 3.3.2 表达条件的优化
  • 4 小结
  • 第三章 间接ELISA 检测方法的建立
  • 1 材料与方法
  • 1.1 材料
  • 1.1.1 实验动物
  • 1.1.2 抗原
  • 1.1.3 抗体
  • 1.1.4 菌种
  • 1.1.5 标准参照物
  • 1.1.6 试剂
  • 1.1.7 主要仪器
  • 1.2 方法
  • 1.2.1 三联融合毒素蛋白包涵体的提取和纯化
  • 1.2.2 豚鼠抗融合毒素蛋白免疫血清的制备
  • 1.2.3 琼脂扩散试验测定血清抗体效价
  • 1.2.4 间接ELISA 最佳工作条件的确定
  • 1.2.5 敏感性试验
  • 1.2.6 特异性试验
  • 1.2.7 样品模拟试验
  • 2 结果
  • 2.1 三联融合毒素蛋白包涵体的提取与纯化
  • 2.2 琼脂扩散试验测定血清抗体效价
  • 2.3 间接 ELISA 最佳工作条件的确定
  • 2.3.1 抗原抗体最佳工作浓度的确定
  • 2.3.2 抗原最佳包被条件的选择
  • 2.3.3 最佳封闭条件的选择
  • 2.3.4 抗原与血清最佳作用时间的确定
  • 2.3.5 酶标二抗最佳工作浓度的确定
  • 2.3.6 酶标二抗与血清最佳作用时间的确定
  • 2.3.7 底物作用时间的确定
  • 2.4 敏感性试验
  • 2.5 特异性试验
  • 2.6 样品模拟试验
  • 3 讨论
  • 3.1 包涵体
  • 3.2 融合毒素蛋白抗体的特性
  • 3.3 间接 ELISA 方法
  • 4 小结
  • 结论
  • 参考文献
  • 附录
  • 致谢
  • 导师简介
  • 作者简介
  • 中文摘要
  • Abstract

    • 相关论文文献

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