人源性噬菌体抗体库的构建和CEA抗体的筛选及表达

论文题目: 人源性噬菌体抗体库的构建和CEA抗体的筛选及表达

论文类型: 硕士论文

论文专业: 外科学

作者: 赵刚

导师: 范健

关键词: 噬菌体抗体库,基因表达,单克隆抗体

文献来源: 东南大学

发表年度: 2005

论文摘要: CEA是人们认识最早的肿瘤相关抗原之一,它在胎儿的结肠表面表达量很高,而在成人CEA浓度很低。但成人患恶性肿瘤和某些炎性疾病时,CEA表达量会明显升高。统计学资料表明大肠癌的CEA表达率为83.3%,肝癌为80%,肺癌为76.6%,乳腺癌为63.2%。CEA本质是一类结构复杂的糖蛋白,分子量180kDa。免疫荧光技术证明CEA存在于肿瘤细胞膜上,是细胞膜的结构蛋白,且在细胞膜上的表达率有所不同。杂交瘤技术的建立使CEA单抗广泛用于生物学研究和医学检测与肿瘤治疗,但其鼠源性引起的人抗鼠反应(HAMA)以及完整单抗分子过大难以进入肿瘤组织内限制了其发展。噬菌体展示技术的出现使得在细菌中克隆人的抗体基因、构建抗体文库、制备人源单克隆抗体成为现实,尤其通过该技术在体外模拟抗体生成过程,达到了不经免疫制备抗体,展示了诱人的前景。在构建抗体库时有诸多因素对库的质量有影响,最重要的是抗体基因的多样性和成熟度,以及库容量的大小。因此,我们在建库时注意到(1)标本取自肠系膜淋巴结。淋巴结是哺乳类特有的,产生免疫应答的重要器官。其淋巴小结内95%的细胞为B细胞,且大多为转化的大B细胞。这些B细胞受滤泡树突细胞表面聚集的抗原的选择作用,已经过数次分裂和膜抗体结构突变过程,只有其膜抗体与表面抗原有高度亲和性的细胞才能保留继续分裂和分化,其余的则均被淘汰,所以选择淋巴结最终会获得高亲合力的抗体。(2)标本来源于高表达CEA(>10ng/ml)的结、直肠癌患者,以使得细胞中含高丰度的抗体mRNA。(3)提取总RNA时,强调RNA的完整性,增加提取和纯化RNA的步骤会减少RNA的多样性,影响库容,所以RNA的纯度达到OD260/OD280的值在1.6以上即可。(4)先构建轻链库,后与克隆的重链基因相连,保证重链基因的多样性。(5)制备高质量的感受态细胞,严格电转化操作,使空质粒转化率达到109才能保证库容达到107以上。从大肠癌患者的肠系膜淋巴结中一步法提取淋巴细胞总RNA约20μg,逆转录合成cDNA,将十个患者的cDNA混合在一起,用PCR扩增κ链和Fd段的基因(Fd段约700bp,κ链约640bp)。κ链基因经纯化、酶切、连接和电转化,构建κ链基因文库,含2.5×107个转化子,随机挑取10个菌落行SacI+XbaI酶切检测,重组率为70%。Fd段扩增产物克隆到κ链基因文库质粒中,计数集落测定库容为5.2×106。XhoI+SpeI酶切检测,Fd段重组率为90%。用SacI+SpeI酶切检测,Fab(约1400bp)重组率为30%。在筛选抗体库过程中,噬菌体种类、固相介质表面抗原密度或溶液中抗原浓度和清洗时间三个因素对筛选效率影响最大。噬菌体的影响随种类不同,没有一定规律,后两个因素是指筛选的严密度。因本次构建的抗体库Fab重组率为30%,所以采用了五轮筛选,前两轮采用中等的严密度,避免高亲和力但低表达的噬菌体克隆丢失。后三轮严格筛选条件达到了筛选目的。第五轮Fab重组率达到100%,噬菌体滴度比第三轮增加了30倍。从第五轮筛选后得到的细菌菌落中挑取30个克隆制备单克隆噬菌体抗体,用ELISA测定其抗原结合活性,其中有6个克隆呈阳性(以P/N>4判定为阳性),阳性率为20%。挑选4株阳性噬菌体抗体感染大肠杆菌XL1-Blue,扩增后提取噬菌粒,构建可溶性Fab表达载体,转化大肠杆菌XL1-blue,经IPTG诱导后收集培养液上清及菌体裂解液上清。ELISA、Western blot检测均证实有3个克隆成功地表达了可溶性的Fab抗体蛋白,可溶性抗体与人CEA有特异结合活性。通过对克隆1的可变区进行序列测定分析与GenBank检索,证实其与人免疫球蛋白IgG重链VH3碱基同源性为90%,氨基酸同源性为88.9%,差异主要集中在CDR2、CDR3区,轻链V区与人免疫球蛋白VK1碱基同源性为93%,氨基酸同源性为91%,CDR1、CDR2、CDR3区均存在氨基酸差异。根据同一家族中核苷酸序列同源性大于80%,说明所获抗体基因重链属于人抗体VH3家族,轻链属于人抗体VK家族。本研究以噬菌体展示技术得到了抗CEA的单克隆抗体并证实了该抗体的有效性,希望使之成为一种理想的免疫治疗的药物,为研究表达CEA的肿瘤患者的治疗提供有益资料。

论文目录:

中文摘要

英文摘要

前言

文献综述CEA 疫苗治疗肿瘤的策略

第一章人源性噬菌体抗体库的构建

1 前言

2 材料与方法

3 结果

4 讨论

第二章辅助噬菌体扩增与定量

1 前言

2 材料与方法

3 结果

4 讨论

第三章抗CEA 噬菌体抗体库的筛选与抗CEA 噬菌体抗体的鉴定

1 前言

2 材料与方法

3 结果

4 讨论

第四章人源性抗CEA 单克隆抗体Fab 段的表达及鉴定

1 前言

2 材料与方法

3 结果

4 讨论

结论

参考文献

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致谢

作者简介

发布时间: 2007-06-11

参考文献

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