青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）致病性差异及其相关基因的分析

论文摘要

青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）是世界性分布的重要植物病原菌，对许多重要的经济作物和观赏性植物可造成严重的危害。该基因组约5.8Mb，具有高（G+C）含量和约5120个可能的编码基因，其致病性机制相当复杂。主要的致病因子有hrp编码的Ⅲ型分泌系统产物、胞外多糖、胞外蛋白、细胞壁降解酶包括果胶质酶以及纤维素酶等，其涉及到的基因主要包括hrp基因簇、avr基因、毒性基因；青枯雷尔氏菌通过Ⅲ型分泌系统（T3SS）、Ⅱ型分泌系统（T2SS）等分泌系统将多种毒性因子输送到胞外使寄主植物致病。而上述致病因子的协调作用是由一个复杂的网络调节系统控制的，并以phcA调节基因的启动和转录为核心，自动而精密地调节有关致病基因的表达及关闭，从而控制细菌的生长状态。本研究利用特异性引物鉴定出85株来自福建地区不同寄主的青枯雷尔氏菌，这些菌株均在504bp位置出现特异性条带。同时，采用BOX插入因子PCR（BOX-PCR）和重复基因外回文序列PCR（REP-PCR）对这些菌株进行基因多样性研究，基于它们的所扩增出的基因指纹图谱表明，BOX-PCR扩增出19条特异性条带，REP-PCR扩增出20条特异性条带。系统聚类结果表明，青枯雷尔氏菌的遗传分化与寄主作物和地理来源都存在相关性。其中，寄主植物是在遗传差异中起主导作用。进一步分析可知，地域性的差异主要由BOX-PCR提供，寄主间的差异主要由REP-PCR提供。同时不同地理来源的青枯雷尔氏菌在BOX-PCR中可扩增出各自特异性条带，不仅如此，在REP-PCR中，同样具有与各个寄主相对应的特异性条带，利用这些特异性条带可以很容易区分不同寄主以及来源的青枯雷尔氏菌。因此，BOX-PCR和REP-PCR多态性分析技术可为我国青枯雷尔氏菌基因多样性的研究提供另一条途径。青枯雷尔氏菌的弱化指数（PI=D1/D2，PI:青枯雷尔氏菌弱化指数，D1:青枯雷尔氏菌菌落红边直径，D2:青枯雷尔氏菌菌落白边直径）与致病性存在着特定的相关性，弱化指数<0.714，被接菌的番茄苗基本上是重度死亡，定义为强致病力青枯雷尔氏菌；弱化指数的范围为0.714-0.833，被接菌的番茄苗基本上是中度死亡，定义为过渡型青枯雷尔氏菌；弱化指数>0.833，被接菌的番茄苗基本上是不死亡，定义为无致病力青枯雷尔氏菌。致病性检测的结果基本上是符合弱化指数分类的结果，这就进一步表明，青枯雷尔氏菌的致病性与其弱化指数有着直接联系。青枯雷尔氏菌致病性机制相当复杂，hrp基因簇在不同致病性青枯雷尔氏菌中差异不大，而phcA基因在青枯雷尔氏菌致病性上起着至关重要的作用。本研究发现在无致病力青枯雷尔氏菌的phcA基因中插入的ISRso21序列可能导致phcA基因的失活中，因此使被插入的菌株呈现出无致病力特性。福建闽北地区ISRso21的阳性率高于其他地区，不同地区的青枯雷尔氏菌ISRso21的分布是有显著性差异的。因此，ISRso21的分布可能与菌株分离个体的地理来源有关。不仅如此，由于ISRso21在青枯雷尔氏菌插入位点的不同，从而导致该致病性的差异。ISRso21的插入位点并不是定向的，它可以在多个插入位点插入。此外，编码共合体决定蛋白T基因、甲基转移酶、整合酶催化基因、依赖DNA的RNA聚合酶基因、PBCV-1DNA连接酶基因、编码HK97家族噬菌体蛋白基因、caudovirus前体蛋白酶和hypothetical protein Bmul0496基因同样也可能在致病性上起着重要作用。利用弱化指数结果、致病性检测结果以及致病性相关基因结果筛选出7株不同致病性青枯雷尔氏菌典型代表菌株，进一步对其生理生化特性进行比较。不同致病性青枯雷尔氏菌的生长速率有所差异，不同致病性青枯雷尔氏菌吸收峰的位置和最大吸收峰的吸光度的值有所不同。同时，不同致病性青枯雷尔氏菌所分泌的胞外蛋白的种类也有所不同，其中强致病力青枯雷尔氏菌所分泌蛋白种类最多，而无致病力青枯雷尔氏菌最少。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1 青枯雷尔氏菌特性
• 1.1 形态特征
• 1.2 分子检测
• 1.3 对植物的侵染过程
• 2 青枯雷尔氏菌致病性的分子机制
• 2.1 致病性基因
• 2.1.1 hrp基因及其分泌系统
• 2.1.2 dsp基因
• 2.2 毒性基因及其分泌系统
• 2.2.1 毒性基因
• 2.2.2 Ⅱ型分泌系统
• 2.3 无毒基因
• 3 青枯雷尔氏菌致病基因的调控网络
• 4 研究目的及创新性
• 第二章 青枯雷尔氏菌的致病性检测
• 1 前言
• 2 材料和方法
• 2.1 材料
• 2.2 方法
• 3 结果与分析
• 3.1 不同致病性青枯雷尔氏菌的形态鉴定
• 3.2 不同致病性青枯雷尔氏菌的分子鉴定
• 3.3 不同致病性青枯雷尔氏菌弱化指数测定
• 3.4 不同致病性青枯雷尔氏菌致病性不同梯度检测
• 3.5 不同致病性青枯雷尔氏菌致病性检测
• 4 讨论
• 第三章 青枯雷尔氏菌遗传多样性分析
• 1 前言
• 2 材料和方法
• 2.1 材料
• 2.2 方法
• 3 结果
• 3.1 不同致病性青枯雷尔氏菌 BOX-PCR 多态性分析
• 3.2 不同致病性青枯雷尔氏菌 REP-PCR 多态性分析
• 3.3 不同致病性青枯雷尔氏菌的分子多态性分析
• 3.4 不同致病性青枯雷尔氏菌地理特性分子多态性分析
• 3.5 不同致病性青枯雷尔氏菌寄主特性分子多态性分析
• 4 讨论
• 第四章 青枯雷尔氏菌的致病相关基因检测
• 1 前言
• 2 材料和方法
• 2.1 材料
• 2.2 方法
• 3 结果与分析
• 3.1 不同致病性青枯雷尔氏菌 hrp 基因簇检测
• 3.1.1 hrpB 和 hrpC 基因检测
• 3.1.2 hrpV-hrpU-hrpT-hrpQ 基因检测
• 3.1.3 hrp O 和 hrp N 基因检测
• 3.2 不同致病性青枯雷尔氏菌 phcA 基因检测
• 3.2.1 phcA 基因扩增
• 3.2.2 phcA 基因分析
• 3.2.3 插入序列分析
• 3.2.4 插入序列 ISRso21 分布
• 3.2.5 IS 序列插入位点的验证
• 3.3 不同致病性青枯雷尔氏菌弱致病性菌株特异性获得相关基因检测
• 3.3.1 特异性获得相关基因筛选
• 3.3.2 特异性获得相关基因 PCR 程序摸索
• 3.3.3 弱致病性菌株特异性获得相关基因检测
• 3.4 不同致病性青枯雷尔氏菌致病性相关基因综合分析
• 3.4.1 相关基因分析
• 3.4.2 弱化指数、致病性检测和致病性相关基因检测综合分析
• 3.4.3 典型代表菌株致病性相关基因图谱条带分析
• 4 讨论
• 第五章 青枯雷尔氏菌的生理生化测定
• 1 前言
• 2 材料和方法
• 2.1 材料
• 2.2 方法
• 3 结果与分析
• 3.1 不同致病性青枯雷尔氏菌菌株生产曲线测定
• 3.2 不同致病性青枯雷尔氏菌菌株紫外扫描
• 3.3 不同致病性青枯雷尔氏菌胞外蛋白的差异分析
• 4 讨论
• 第六章 结论与展望
• 参考文献
• 附录
• 个人简历
• 致谢