论文摘要
目的Caspase8、9在肿瘤局部微循环构建早期线形程序性坏死（Linearly Patterned programmed cell necrosis, LPPCN）及血管生成拟态（vasculogenic mimicry, VM）形成中上皮-间充质转变（epithelial-mesenchymal transition, EMT）调控蛋白表达的关联性研究。通过应用Caspase8抑制剂抑制凋亡启动通路中的死亡受体通路,应用Caspase9抑制剂抑制凋亡启动通路中的线粒体通路,抑制LPPCN形成与VM形成,加剧肿瘤组织内部微环境的缺氧缺血程度,分析LPPCN周围第Ⅰ-Ⅳ层肿瘤细胞和VM周围第Ⅰ-Ⅳ层肿瘤细胞EMT相关调控蛋白的表达情况,初步阐明发生EMT的肿瘤细胞在VM形成中的重要作用。方法1.实验动物模型的建立C57小鼠荷瘤模型的建立：将存于液氮的B16黑色素瘤组织于43℃水浴锅内放置20-40s, lOOOrpm离心10min,弃上清。剪碎肿瘤组织,用生理盐水将细胞浓度调制0.2×107/m1。C57小鼠共96只,将B16单细胞悬液注射到C57小鼠左鼠蹊部,待小鼠荷瘤后,将小鼠随机平均分为Caspase8抑制剂组、Caspase9抑制剂组、Caspase8+9抑制剂联合用药组和对照组。处死小鼠后,每组小鼠分别剖取移植瘤,福尔马林溶液固定,石蜡包埋制作组织切片。2.LPPCN和VM周围肿瘤细胞EMT相关蛋白的表达情况在石蜡切片上对比研究Caspase8抑制剂组、Caspase9抑制剂组、Caspase8+9抑制剂联合用药组和对照组中LPPCN的条带数与VM的数量,LPPCN和VM周围肿瘤细胞尤其是LPPCN和VM周围第Ⅰ-Ⅳ层肿瘤细胞EMT相关蛋白的表达情况,揭示LPPCN周围肿瘤细胞尤其是第Ⅰ-Ⅳ层肿瘤细胞在VM形成过程中可能发挥的重要作用。LPPCN周围第Ⅰ-Ⅳ层肿瘤细胞分别为LPPCN周围第1-4圈肿瘤细胞；VM周围第Ⅰ-Ⅳ层肿瘤细胞分别为VM周围第1-4圈肿瘤细胞。结果1.各组LPPCN数量的差别Caspase8抑制剂组（11.30±1.930）、Caspase9抑制剂组（22.23±4.133）、Caspase8+9抑制剂联合用药组（19.60±2.579）中LPPCN的条带数明显少于对照组（31.57±5.352）,差别有统计学意义（F=5.310,P=0.002）,尤其是Caspase8抑制剂组、Caspase8+9抑制剂联合用药组和对照组相比LPPCN条带数减少更加明显（Caspase8抑制剂组与对照组相比q=20.271, P=0.007; Caspase8+9抑制剂联合用药组和对照组相比q=11.971,P=0.021）2.各组VM数量的差别Caspase8抑制剂组（1.90±0.232）、Caspase9抑制剂组（2.00±0.328）、Caspase8+9抑制剂联合用药组（2.03±0.222）与对照组比较（2.61±0.246）,VM形成数量没有变化,差别无统计学意义（F=1.558,P=0.204）。应用Caspase抑制剂后VM形成无明显变化。3.各组LPPCN和VM周围第Ⅰ-Ⅳ层肿瘤细胞EMT相关蛋白的表达情况Caspase8抑制剂组、Caspase9抑制剂组、Caspase8+9抑制剂联合用药组和对照组的LPPCN周围第Ⅰ-Ⅳ层肿瘤细胞Twist 1核阳性染色指数,差别有统计学意义（Caspase8抑制剂组F=9.029, P=0.000、Caspase9抑制剂组F=5.035,P=0.006、Caspase8+9抑制剂联合用药组F=6.356,P=0.002、对照组F=15.259,P=0.000）;LPPCN周围同一层肿瘤细胞Twist1核阳性染色指数,差别有统计学意义（第Ⅰ层F=5.894,P=0.003、第Ⅱ层F=6.715,P=0.001、第Ⅲ层F=4.892,P=0.007、第Ⅳ层F=5.732,P=0.003）。VM周围第Ⅰ-Ⅳ层肿瘤细胞Twistl核阳性染色指数,差别比较均无统计学意义（Caspase8抑制剂组F=0.906,P=0.449、Caspase9抑制剂组F=0.189, P=0.905、Caspase8+9抑制剂联合用药组F=0.711,P=0.553、对照组F=1.406,P=0.262）;VM周围同一层肿瘤细胞Twist 1核阳性染色指数,差别均无统计学意义（第Ⅰ层F=0.233,P=0.873、第Ⅱ层F=0.275,P=0.843、第Ⅲ层F=0.426,P=0.736、第Ⅳ层F=0.608,P=0.645）。Caspase8抑制剂组、Caspase9抑制剂组、Caspase8+9抑制剂联合用药组和对照组的LPPCN周围第Ⅰ-Ⅳ层肿瘤细胞Twist1浆阳性染色指数,差别比较无统计学意义（Caspase8抑制剂组F=0.096, P=0.962、Caspase9抑制剂组F=0.054,P=0.983、Caspase8+9抑制剂联合用药组F=1.309,P=0.277、对照组F=0.226,P=0.878）; LPPCN周围同一层肿瘤细胞Twist1浆阳性染色指数,差别比较无统计学意义（第Ⅰ层F=2.488,P=0.066、第Ⅱ层F=2.292,P=0.084、第Ⅲ层F=0.062,P=2.357、第Ⅳ层F=2.262,P=0.087）。VM周围第Ⅰ～Ⅳ层肿瘤细胞Twist1浆阳性染色指数,差别比较均无统计学意义（Caspase8抑制剂组F=O.35O, P=0.789、Caspase9抑制剂组F=0755, P=0.522、Caspase8+9抑制剂联合用药组F=0.571,P=0.636、对照组F=1.005,P=0.395）；VM周围同一层肿瘤细胞Twist1浆阳性染色指数,差别均无统计学意义（第Ⅰ层F=2.186,P=0.096、第Ⅱ层F=1.756,P=0.162、第Ⅲ层F=1.120,P=0.346、第Ⅳ层F=2.105,P=0.106）。Caspase8抑制剂组、Caspase9抑制剂组、Caspase8+9抑制剂联合用药组和对照组的LPPCN周围第Ⅰ～Ⅳ层肿瘤细胞Snail染色指数,差别比较有统计学意义（Caspase8抑制剂组F=3.359, P=0.021、Caspase9抑制剂组F=1.115,P=0.347、Caspase8+9抑制剂联合用药组F=1.191,P=0.317、对照组F=0.493,P=0.688）；LPPCN周围同一层肿瘤细胞Snail染色指数,差别比较有统计学意义（第I层F=6.810,P=0.000、第Ⅱ层F=13.132,P=0.000、第Ⅲ层F=14.571,P=0.000、第Ⅳ层F=13.612,P=0.000）VM周围第Ⅰ～Ⅳ层肿瘤细胞Snail染色指数,差别比较无统计学意义（Caspase8抑制剂组F=1.590, P=0.196, Caspase9抑制剂组F=1.386, P=0.251、Caspase8+9抑制剂联合用药组F=2.267,P=0.084、对照组F=1.997,P=0.119）；VM周围同一层肿瘤细胞Snail染色指数,差别比较无统计学意义（第Ⅰ层F=1.446,P=0.443、第Ⅱ层F=3.183,P=0.027、第Ⅲ层F=0.920,P=0.433、第Ⅳ层F=2.371,P=0.074）。Caspase8抑制剂组、Caspase9抑制剂组、Caspase8+9抑制剂联合用药组和对照组的LPPCN周围第Ⅰ～Ⅳ层肿瘤细胞Slug染色指数,差别比较有统计学意义（Caspase8抑制剂组F=6.446, P=0.000、Caspase9抑制剂组F=31.339,P=0.000、Caspase8+9抑制剂联合用药组F=2.659,P=0.052、对照组F=3.785,P=0.013）；LPPCN周围同一层肿瘤细胞Slug染色指数,差别比较有统计学意义（第Ⅰ层F=4.888,P=0.003、第Ⅱ层F=4.221,P=0.007、第Ⅲ层F=4.777,P=0.004、第Ⅳ层F=6.642,P=0.000）VM周围第Ⅰ～Ⅳ层肿瘤细胞Slug染色指数,差别比较无统计学意义（Caspase8抑制剂组F=0.574, P=0.633、Caspase9抑制剂组F=2.009, P=0.117、Caspase8+9抑制剂联合用药组F=2.391,P=0.071、对照组F=0.776, P=0.510）; VM周围同一层肿瘤细胞Slug染色指数,差别比较无统计学意义（第Ⅰ层F=0.559,P=0.643、第Ⅱ层F=0.995,P=0.398、第Ⅲ层F=1.312,P=0.274、第Ⅳ层F=0.766,P=0.515）。Caspase8抑制剂组、Caspase9抑制剂组、Caspase8+9抑制剂联合用药组、对照组的LPPCN周围第Ⅰ-Ⅳ层肿瘤细胞E-cadherin染色指数,差别比较无统计学意义（Caspase8抑制剂组F=O.277,P=0.842.Caspase9抑制剂组F=0.020,P=O.996、Caspase8+9抑制剂联合用药组F=0.087,P=0.993、对照组F=0.031,P=O.993）:LPPCN周围同一层肿瘤细胞E-cadherin染色指数,差别比较无统计学意义（第Ⅰ层F=0.419,P=0.740、第Ⅱ层F=0.177,P=0.912、第Ⅲ层F=0.177,P=0.912、第Ⅳ层F=0.322,P=0.809）VM周围第Ⅰ-Ⅳ层肿瘤细胞E-cadherin染色指数,差别比较无统计学意义（Caspase8抑制剂组F=0.676,P=0.569、Caspase9抑制剂组F=O.730,P=0.536、Caspase8+9抑制剂联合用药组F=0.478,P=0.698、对照组F=0.261,P=O.854）:VM周围同一层肿瘤细胞E-cadherin染色指数,差别比较无统计学意义（第Ⅰ层F=0.967,P=0.411、第Ⅱ层F=1.188,P=0.317、第Ⅲ层F=0.633,P=0.595、第Ⅳ层F=0.632,P=0.667）。Caspase8抑制剂组、Caspase9抑制剂组、Caspase8+9抑制剂联合用药组和对照组的LPPCN周围第Ⅰ-Ⅳ层肿瘤细胞Vimentin染色指数,差别比较无统计学意义（Caspase8抑制剂组F=1.573,P=O.200.Caspase9抑制剂组F=0.560,P=0.642、Caspase8+9抑制剂联合用药组F=2.644,P=0.051、对照组F=1.910,P=0.132）:LPPCN周围同一层肿瘤细胞Vimentin染色指数,差别比较无统计学意（第Ⅰ层F=2.064,P=0.109、第Ⅱ层F=3.679,P=0.014、第Ⅲ层F=3.898,P=0.011、第Ⅳ层F=1.852,P=0.142）VM周围第Ⅰ-Ⅳ层肿瘤细胞Vimentin染色指数,差别比较无统计学意义（Caspase8抑制剂组F=1.982,P=0.12l、Caspase9抑制剂组F=2.360,p=0.075.Caspase8+9抑制剂联合用药组F=1.399,P=0.247、对照组F=1.399,P=O.128）: VM周围同一层肿瘤细胞Vimentin染色指数,差别比较无统计学意义（第Ⅰ层F=1.310,P=0.274、第Ⅱ层F=0.665,P=0.575、第Ⅲ层F=1.329,P=0.268、第Ⅳ层F=2.405,P=0.071）。Caspase8抑制剂组、Caspase9抑制剂组、Caspasc8+9抑制剂联合用药组和对照组的LPPCN周围第Ⅰ-Ⅳ层肿瘤细胞Fibronectin染色指数,差别比较无统计学意义（Caspase8抑制剂组F=O.611,P=0.609.Caspase9抑制剂组F=2.144, P=0.099.Caspase8+9抑制剂联合用药组F=0.768,P=0.541、对照组F=2.678, P=0.074）:LPPCN周围同一层肿瘤细胞Fibronectin染色指数,差别比较无统计学意义（第Ⅰ层F=1.071,P=0.364、第Ⅱ层F=0.870,P=0.459、第Ⅲ层F=0.937,P=0.427、第Ⅳ层F=O.655,P=O.582）VM周围第Ⅰ-Ⅳ层肿瘤细胞Fibronectin染色指数,差别比较无统计学意义（Caspase8抑制剂组F=1.053,P=0.372、Caspase9抑制剂组F=0.733, P=0.543、Caspase8+9抑制剂联合用药组F=0.538,P=0.657、对照组F=2.620, P=0.054）; VM周围同一层肿瘤细胞Fibronectin染色指数,差别比较无统计学意义（第Ⅰ层F=0.611,P=0.609、第Ⅱ层F=1.102,P=0.390、第Ⅲ层F=2.459,P=0.066、第Ⅳ层F=1.262,P=0.291）。结论1.C57BL小鼠黑色素瘤中确实存在LPPCN。LPPCN是一种有别于凋亡和坏死这两种经典的细胞死亡模式的新的肿瘤细胞死亡模式,其死亡途径最终可能是受线粒体凋亡途径调控,但形态学上却表现为坏死细胞的特征。2.通过抑制Caspase8,9可以抑制LPPCN的形成,尤其是抑制Caspase8和同时抑制Caspase8,9后LPPCN数量减少更加明显；LPPCN是Caspase依赖性的死亡通路。3.通过抑制Caspase8,9不能有效的抑制VM的形成,抑制Caspase8,9后VM形成数量无明显变化。4. LPPCN和VM周围肿瘤细胞尤其是周围第Ⅰ-Ⅳ层肿瘤细胞确有EMT相关蛋白的表达。LPPCN和VM周围肿瘤细胞尤其是周围第Ⅰ-Ⅳ层肿瘤细胞E-cadherin几乎不表达,而Twistl、Snail、Slug、Vimentin和Fibronetin表达,说明这些肿瘤细胞确实发生了EMT。5.抑制Caspase8，9后,LPPCN和VM周围肿瘤细胞尤其是周围第Ⅰ-Ⅳ层肿瘤细胞EMT相关蛋白的表达情况。抑制Caspase8、9之后,随着LPPCN数量形成的减少,LPPCN周围肿瘤细胞尤其是周围第Ⅰ-Ⅳ层肿瘤细胞EMT相关蛋白Twist1核表达、Snail表达、Slug表达呈逐层下调趋势,而Twist1浆表达、E-cadherin表达、Vimentin表达和Fibronectin表达无明显变化。而VM周围肿瘤细胞尤其是周围第Ⅰ-Ⅳ层肿瘤细胞EMT相关蛋白Twist1核表达、Twist1浆表达、Snail表达、Slug表达、E-cadherin表达、Vimentin表达和Fibronectin表达无明显变化。6. LPPCN周围肿瘤细胞尤其是周围第Ⅰ-Ⅳ层肿瘤细胞可能为VM的形成提供重要的物质基础。EMT是指上皮细胞失去上皮表型转变为间充质细胞表型的现象,EMT参与了胚胎发育、组织形成、伤口愈合、多种纤维化疾病的形成、肿瘤的发生与发展和侵袭转移等过程。细胞发生EMT后黏附连接、紧密连接、桥粒连接等细胞间连接解体,细胞分散；立方上皮细胞的细胞角蛋白结构改变,外形为纺锤形纤维细胞态；细胞骨架重排,形成细胞-基质黏附,细胞运动能力增强；同时,细胞具有了分泌TGF-β、TNF-α、MCP-1、IGF、FGF等多种细胞因子,分泌基质金属蛋白酶类降解ECM,分泌Ⅳ型胶原、PAS阳性物质等ECM的成分,是ECM发生重塑。因而,发生EMT的LPPCN周围肿瘤细胞尤其是周围第Ⅰ-Ⅳ层肿瘤细胞有可能为VM的形成提供重要的物质基础。