猪骨髓基质细胞的分离培养及向软骨细胞分化的研究

论文摘要

骨髓基质干细胞（Bone marrow stromal cells,BMSCs）是一类具有多向分化潜能的组织干细胞,在体内外适当的诱导环境下可以分化成为骨、软骨、脂肪、肌肉、神经、肌腱及韧带等多种细胞和组织。该细胞来源充足,取材方便,增殖能力强,可以在体外大规模扩增而不丢失多向分化潜能,并且异体移植免疫排斥反应小。目前,已成为应用较广泛的重要种子细胞之一。为了获得充足的骨髓基质干细胞来源,我们建立了猪骨髓基质干细胞的分离方法,通过体外培养和生物学鉴定,证实其为骨髓基质干细胞,并具有成骨分化性能。通过体外转导pEGFP-C1-TGF-β1入骨髓基质干细胞,在条件培养基作用下诱导其向软骨细胞分化。以期为骨组织工程和软骨损伤修复的研究提供新的策略,获得了以下结果:1.无菌采取猪股骨头,采用骨钳钳破骨髓腔,收集骨髓液于无菌离心管,沉淀制成悬液接种于培养皿,于37℃、5 % CO2条件下培养。培养的细胞为单层贴壁生长,呈成纤维样形态。CD44因子免疫组化鉴定为阳性;条件培养基诱导成骨分化,ALP染色阳性,并有矿化结节生成;结合细胞形态学观察,结果表明,分离培养的细胞为骨髓基质干细胞。开始时大多为细长梭形,增殖速度快,细胞传代周期延短,待传至第7、8代时细胞铺展得宽大而扁薄,增殖速度减慢,细胞传代周期延长,细胞内颗粒物质增多。2.从猪外周血淋巴细胞中抽提总RNA,并用TGF-β1特异性引物扩增获得TGF-β1全基因,并将TGF-β1全基因亚克隆到带有绿色荧光蛋白报告基因的真核表达质粒pEGFP-C1。3.并用脂质体法转染BMSCs,通过直接荧光观察pEGFP-C1-TGF-β1融合蛋白在细胞中的分布定位,结果在转染后观察到绿色荧光,间接免疫荧光法检测TGF-β1表达均为阳性,转染后细胞失去BMSCs典型的成纤维形态,而呈现出三角、多角形态。Ⅱ型胶原免疫组化染色检测显示,转染TGF-β1基因后的BMSCs开始表达软骨细胞表面特异性标志物Ⅱ型胶原。综上所述,本研究在成功分离培养猪BMSCs的基础上,将TGF-β1基因转入BMSCs后,表达了软骨细胞表面标志物,说明BMSCs已向软骨细胞分化。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 文献综述
• 第一章 骨髓基质细胞分离培养及诱导分化研究进展
• 1.1 骨髓基质细胞的分离培养
• 1.1.1 骨髓基质细胞概述
• 1.1.2 骨髓基质干细胞分离及鉴定
• 1.2 骨髓基质细胞的诱导分化
• 1.2.1 细胞因子的作用
• 1.2.2 化学物质的作用
• 1.2.3 BMSCs 向神经细胞诱导分化
• 1.2.4 BMSCs 向心肌细胞诱导分化
• 1.2.5 BMSCs 向成软骨细胞诱导分化
• 1.2.6 BMSCs 向成肌细胞、脂肪细胞、血管内皮细胞的诱导分化
• 1.3 骨髓基质细胞的应用进展
• 1.3.1 骨髓基质干细胞在骨组织工程学中的应用
• 1.3.2 MSCs 应用于肌肉、肌腱再生
• 1.3.3 MSC 应用于造血系统
• 1.3.4 MSC 应用于神经系统
• 试验研究
• 第二章 猪BMSCS 的分离培养及生物学特性研究
• 2.1 材料
• 2.1.1 实验动物
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 主要仪器与设备
• 2.1.4 细胞培养用试剂
• 2.2 方法与步骤
• 2.2.1 猪BMSCs 分离及原代培养
• 2.2.2 猪BMSCs 传代培养
• 2.2.3 猪BMSCs 生长曲线、分裂指数曲线和贴壁率的测定
• 2.2.4 猪BMSCs 向成骨细胞诱导
• 2.2.5 碱性磷酸酶（ALP）染色
• 2.2.6 细胞免疫化学法鉴定BMSCs
• 2.2.7 衰老细胞染色
• 2.3 结果
• 2.3.1 细胞形态及生长特征
• 2.3.2 猪BMSCs 成活率检测
• 2.3.3 猪BMSCs 传代培养
• 2.3.4 猪BMSCs 生长曲线、分裂指数曲线及贴壁率
• 2.3.5 猪BMSCs 碱性磷酸酶（ALP）染色
• 2.3.6 猪BMSCs 的免疫化学鉴定
• 2.3.7 猪BMSCs 的衰老细胞染色结果
• 2.4 讨论
• 2.5 小结
• 第三章 PEGFP-C1-TGF-Β1 真核表达质粒的构建与鉴定
• 3.1 材料
• 3.1.1 质粒、细胞及主要试剂
• 3.1.2 主要试剂配制
• 3.2 方法
• 3.2.1 猪TGFβ1 全基因的扩增、克隆及序列测定
• 3.2.2 重组真核表达质粒pEGFP-C1-TGF-β1 的构建
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 TGF-β1 基因RT-PCR 鉴定
• 3.3.2 重组质粒pMD18-T -TGF-β1 的酶切、PCR 及序列测定
• 3.3.3 重组真核表达质粒pEGFP-C1-TGF-β1 的鉴定
• 3.4 讨论
• 3.5 小结
• 第四章 猪骨髓基质细胞向软骨细胞分化的研究
• 4.1 材料
• 4.1.1 主要试剂
• 4.1.2 软骨细胞诱导分化液
• 4.1.3 主要仪器与设备
• 4.2 方法
• 4.2.1 pEGFP-C1-TGF-β1 质粒纯度和浓度的检测
• 4.2.2 pEGFP-C1-TGF-β1 质粒转染猪骨髓基质细胞
• 4.3 结果
• 4.3.1 pCI-neo-hTERT 质粒纯度和浓度的检测
• 4.3.2 新霉素（G418）对猪骨髓基质细胞最佳维持浓度的确定
• 4.3.3 转染细胞形态和特征
• 4.3.4 分组诱导分化结果
• 4.3.5 Ⅱ型胶原免疫组化染色
• 4.4 讨论
• 4.5 小结
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历