人NGAL原核表达及多克隆抗体的制备

论文摘要

研究目的：人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（neutrophil gelatinase-associated lipocalin, NGAL）是Kjeldsen等人于1993年在中性粒细胞的特殊颗粒中首先发现的。以往的研究表明NGAL与炎症、胚胎发育、免疫应答、趋化作用、信号转导以及多种肿瘤的发生与发展等过程密切相关。NGAL在乳腺癌、食管癌、结直肠癌、胃癌、慢性粒细胞性白血病等细胞系中均过表达,并在癌细胞的浸润与不良分化中发挥重要的作用。进一步研究证实,NGAL是多种原因引起的肾损伤的一个保护因素并且由于分子量小,对蛋白酶有天然的抗性,NGAL在肾脏损伤后很快聚积,在尿液中出现早,可作为急性肾衰的诊断标记物,是有效评价急性肾衰临床治疗效果及预后的良好指标。本文构建NGAL原核表达载体,并在原核细胞中诱导表达人NGAL的融合蛋白pET28a-NGAL,融合蛋白经纯化后作为抗原,免疫动物,制备多克隆抗体,为进一步阐明NGAL生物学功能奠定基础。研究方法：1构建NGAL原核表达载体用RT-PCR方法从K562细胞株总RNA中克隆NGAL的cDNA片段,以此片段为模板行PCR,再将扩增片段与载体pET28a同时用HindⅢ和BamHⅠ双酶切,回收后将目的片段连接入原核表达载体pET28a中,将NGAL原核表达质粒转化Ecoli Rosetta DE3、筛选阳性菌落、提取质粒后双酶切、载体测序引物进行测序。将测序结果和NGAL基因的ORF序列及pET28a载体多克隆位点进行同源比较,检测原核表达载体pET28a-NGAL克隆正确。2 pET28a-NGAL融合蛋白的诱导表达pET28a及表达载体pET28a-NGAL转化大肠杆菌Rosetta DE3,菌落PCR、再小量提质粒后,行双酶切和测序鉴定正确后。再以最终浓度为1mM IPTG诱导目的蛋白在Rosetta DE3中表达,目的蛋白诱导表达3h后,分别收集上清液和沉淀,再行SDS-PAGE电泳,考马斯亮蓝染色后,凝胶成像分析电泳图像,融合蛋白表达率由Quantity One分析所得。3 pET28a-NGAL多克隆抗体制备将大量扩增的融合蛋白行SDS-PAGE电泳,经考马斯亮蓝染色鉴定有目的融合蛋白表达,再对照标准蛋白Marker,切取同等条件下经KCL染色含目的蛋白条带的凝胶,PBS充分研磨、反复冻融后取上清,将其与同体积弗氏完全佐剂混合,多点注射入家兔背部皮下,每2周免疫一次,共计4次（后三次加强免疫时选用弗氏不完全佐剂）。末次免疫后10天,选用颈动脉放血法提取抗血清,抗血清经饱和硫酸铵法粗纯后,再过羊抗兔IgG亲和柱进行精纯,分装后-20℃保存。4.抗体特异性检测ELISA确定抗血清效价后,不同稀释浓度确定该抗体的最适滴度,再利用自制多克隆抗体（1：1000稀释）,进行western blot实验,检测NGAL融合总蛋白和切胶纯化蛋白的表达。以验证自制多克隆抗体对NGAL抗原特异性的识别。并以此抗体用于免疫组化实验检测乳腺癌组织中NGAL的表达。结果：1NGAL原核表达载体的构建经RT-PCR扩增出约625bp的目的片段,与预期结果一致。重组质粒pET28a-NGAL转化感受态细胞Rosetta DE3,经HindⅢ、BamHⅠ双酶切,分别在5369bp和625bp处有两条清晰的条带,与质粒pET28a和NGAL基因片段的分子量一致,测序结果与pET28a载体多克隆位点及NGAL序列进行同源比较后,证明融合区域的读码框正确,并有正确的方向,表明质粒pET28a-NGAL克隆正确。2 NGAL融合蛋白的诱导表达重组质粒转化经1mM IPTG诱导3h后,分别收集上清及菌体,行聚丙稀酰胺凝胶电泳后,考马斯亮蓝染色。染色结果显示：融合蛋白主要以包涵体的形式存在于沉淀中,IPTG诱导的融合蛋白电泳后在25KD左右位置发现明显深染蛋白条带,而未经IPTG诱导的融合蛋白未见该条带。并且随着IPTG诱导时间的增加,蛋白表达量也增加,3小时后达到高峰,以后随着诱导时间的延长表达量没有明显变化。实验证明：融合蛋白pET28a-NGAL在Rosetta DE3菌体中得到了高效表达。Quantity One分析融合蛋白表达率为12.2%。3 NGAL多克隆抗体的制备大量扩增诱导融合蛋白表达后,收集包涵体形式的融合蛋白,行SDS-PAGE电泳,切取目的蛋白染色胶带,PBS溶解凝胶颗粒,测蛋白浓度,按照每只兔子每次需要0.3mg蛋白量计算免疫动物,收集纯化蛋白,按照免疫兔所需要的融合蛋白量进行免疫。3次增强免疫结束后,采集并分离血清,纯化血清免疫球蛋白IgG。4 NGAL多克隆抗体的鉴定Western blot检测融合总蛋白和切胶纯化蛋白。ECL显色结果显示,自制抗体可在预期位置检测出目的条带。免疫组化结果显示,NGAL在乳腺癌组织中有阳性表达,蛋白定位主要在细胞质。上述结果表明,自制NGAL多克隆抗体可用于检测内源性NGAL蛋白,用于后续实验。利用不同稀释度的NGAL多克隆抗体和相应的HRP羊抗兔酶标二抗,重复上述实验。结果证实一抗最佳抗体稀释度为l：1000,二抗稀释度为1：5000时实验结果最佳。结论：构建了NGAL基因原核表达载体,诱导NGAL融合蛋白的表达,并以纯化的融合蛋白制备了NGAL多克隆抗体,经验证该抗体可用于内源性NGAL蛋白的检测。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 中英缩略词对照
• 第1章 引言
• 第2章 材料和方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 细胞株和菌株
• 2.1.2 主要仪器
• 2.1.3 主要试剂
• 2.1.4 主要试剂配制
• 2.2 方法
• 2.2.1 K562细胞培养
• 2.2.2 NGAL原核表达载体的构建策略
• 2.2.3 K562细胞总RNA的提取
• 2.2.4 两步法RT-PCR
• 2.2.5 质粒pET28a和NGAL的双酶切（HindⅢ、BamHⅠ）反应,DNA片段回收及T4连接反应
• 2.2.6 将连接产物pET28a-NGAL转化大肠杆菌Rosetta DE3
• 2.2.7 pET28a-NGAL重组基因的鉴定
• 2.2.8 NGAL融合蛋白的诱导表达及切胶纯化
• 2.2.9 NGAL多克隆抗体的制备
• 2.2.10 兔抗人NGAL多克隆抗体滴度和特异性检测
• 第3章 结果
• 3.1 原核表达载体的构建
• 3.2 酶切鉴定重组载体
• 3.3 SDS-PAGE检测在大肠杆菌Rosetta DE3中目的蛋白的表达
• 3.4 目的蛋白可溶性分析
• 3.5 切胶纯化后目的蛋白的检测
• 3.6 多克隆抗体的效价及特异性检测
• 3.7 抗NGAL多克隆抗体检测乳腺癌组织中NGAL的表达
• 第4章 讨论
• 4.1 研究人NGAL蛋白的现状和意义
• 4.2 重组质粒的构建及融合蛋白的表达
• 4.3 抗体制备
• 第5章 结论
• 致谢
• 参考文献
• 攻读学位期间发表论文情况
• 综述
• 参考文献