1遵义医学院深圳市儿童医院深圳518038；2深圳华大基因研究院深圳518083
【摘要】急性淋巴细胞白血病（ALL）占儿童恶性肿瘤性疾病的首位，尽管儿童ALL治疗已取得很大进展，但复发仍是我们面临的难题。白血病的微小残留病（MRD）状态是复发的根源。研究表明，对患者进行定期MRD检测具有重要的临床指导意义。目前临床上通过实时定量PCR、流式细胞术和原位荧光杂交等技术检测白血病微小残留病（MRD），但是这些技术都有各自的局限，导致一定程度的漏检或假阳性。免疫组库高通量测序技术（IR-SEQ）的高灵敏度和高特异性，能够更加全面地检测MRD。本文将对IR-SEQ技术在检测ALL-MRD中的研究进展进行综述。
【关键词】急性淋巴细胞白血病；微小残留病；免疫组库；高通量测序
急性淋巴细胞白血病（acutelymphoblasticleukemia，ALL）在儿童所有恶性肿瘤性疾病中占据首位，且有逐年增加的趋势，我国每年约有1.5-2万名新发儿童白血病，其中急性淋巴细胞白血病占80%左右，是小儿时期最常见的白血病类型，发病高峰年龄为3～4岁，是严重威胁小儿生命和健康的疾病之一。
随着诊疗技术水平的增高，人们对儿童白血病经过形态学、免疫学、遗传学及分子生物学检测综合分析（MICM分型）的方法对急性白血病进行了精确的诊断和分型、分层治疗使得儿童ALL的诊疗水平方面得到了质的飞跃，但仍有20%～30%患儿在缓解后复发[1-3]，这与体内仍存在形态学无法检测的残留白血病细胞，即微小残留白血病（minimalresidualdisease，MRD）有关。因此，在治疗过程中对白血病患者进行定期MRD检测，具有重要的临床指导意义。目前用于临床评估MRD的技术包括流式细胞术（flowcytometry，FCM）、实时定量PCR（real-timequantificationpolymerasechainreaction，RQ-PCR）和原位荧光杂交等技术[4]，但是这些技术都有各自的局限，导致一定程度的漏检或假阳性，也都无法监测治疗过程中病人整体的免疫系统重建情况。免疫组库测序技术（immunerepertoiressequencing，IR-SEQ）的高灵敏度和高特异性，能够更加全面地检测MRD，在一定程度上弥补传统方法的不足。
1免疫组库高通量测序技术的介绍
1.1高通量测序
高通量测序技术（high-throughputsequencing，HTS），第二代测序技术，又被称为“下一代测序”（nextgenerationsequencing，NGS）[5]。二代测序技术具有很高的通量，能够同时并行检测几十万到几百万的DNA分子[6，7]，能够用来对进行基因组水平的转录组或者基因组的分析。二代测序一般采用连接酶或者聚合酶，一般是同步化三磷酸核苷酸的洗脱和同步化的荧光检测方法相结合，采用“边合成边测序”的方法，输出短的连续性的DNA片段序列。根据测序原理和技术的不同，主要的技术平台包括以下几种：Roche/454FLX、IlluminaHiseq系列和ABISOLID系列。其中，应用做广泛的，仍然是Hiseq系列。
IlluminaHiseq测序技术其前身是solexa测序技术，依靠其专利核心技术“DNA簇”和“可逆性末端终结”技术，能够实现样本制备的自动化和高通量的碱基大规模平行测序。主要的步骤是：1）将待测的DNA制备成一定大小的DNA片段的文库，在片段的两端加上接头；2）将模板DNA加到芯片上，进行桥式扩增，形成DNA簇；3）进行边合成边测序。边合成边测序的核心的原理是，在合成新的DNA互补链时，加入改造后的DNA聚合酶和带有荧光标记的4种dNTP，这些dNTP是“可逆性终止子”，其3’端带有化学修饰的部分，未切除掉该修饰时，不能连接下一个碱基，能够保证每轮反应只连接一个核苷酸。在掺入单个碱基后，用激光扫描整个芯片，读取每条模板序列所聚合上的核苷酸种类，之后切除掉末端修饰，掺入下一个碱基，这样，统计每个循环的碱基种类，就得到了所测DNA片段的信息。
目前，Hiseq测序技术的序列读长已经可以达到2×250bp，其读长受到多种影响荧光信号的因素影响，例如荧光标记的不完全的切除。总的来说，IlluminaHiseq系列具有通量较高、准确率较高、成本较低、所需要样本量少、简单快速等优点，是目前最常用的测序平台。
1.2免疫组库技术
免疫组库（immunerepertoire，IR）是指，在一个特定时间点，某个样本的免疫系统中所有有功能的的T细胞和B细胞的总和，即人体的特异性免疫系统的细胞的总和。免疫组库测序技术（immunerepertoiressequencing，IR-SEQ）是用高通量测序的方法研究免疫系统中B细胞和T细胞的多样性和特异性的技术，因此，免疫组库技术的主要研究对象仍是BCR和TCR的CDR区。由于BCR基因组成的V和J基因种类非常多，因此，需要采用多重PCR的方法对其进行扩增和捕获。其原理是在B细胞表面受体的V基因和J基因的保守区域设计多重PCR引物，通过多重PCR技术扩增B细胞表面受体的互补决定区CDR3区域，用高通量测序的方法，对大量B细胞的CDR3区进行检测和识别，以此来研究免疫系统中复杂多样的B细胞和T细胞。
2抗原受体基因重排用于MRD检测
早在HTS技术出现之前，就有很多通过检测抗原受体基因重排检测急性淋巴细胞白血病的研究，应用较早还是RQ-PCR的技术。MBrüggemann等的研究发现92%的T-ALL中存在克隆性的TRB基因重排，为TRB基因重排作为T-ALL微小残留病检测的分子标记奠定了基础[8]。TFlohr等人同样利用RQ-PCR的技术，对儿童的急性淋巴细胞白血病的IHG基因和TCR的重排进行了研究，他们发现，在B细胞类型的急性淋巴细胞白血病中，83%的病人样本能够检测到IGH基因的重排[9]，除此之外，MichaelJ也进行了类似的研究，他们也是采用RQ-PCR的方法，在43个B-ALL样品中，有37个样本检测到了V-J的重排，有4个样本检测到了D-J的不完全重排[10]，这为后面的高通量测序方法提供了依据。
3高通量免疫组库测序技术用于MRD检测
HTS使测定复杂的适应性免疫分子成为可能，免疫组库测序技术应运而生，并展示了巨大的优势。该技术分别在T/B细胞受体的V基因和J（或C）基因区设计引物，PCR扩增富集代表T/B细胞多样性的CDR3区域，然后分析测序得到的数十万条T/B细胞受体序列的多样性情况[11-13]。2009年，Boyd等用Immu-Seq的方法在淋巴细胞增殖性疾病（如慢性淋巴性白血病）患者的外周血中找到克隆性增殖的抗体重链基因（IGH），第一次证明了用免疫组库高通量测序的方法检测MRD的可能性[11]。2012，HarlanRobins实验室首先将免疫组库高通量测序技术用于T-ALLMRD的检测，发现免疫组库高通量测序方法的敏感性要高于流式细胞术，在白血病残留细胞的水平低于10-5时仍然可以检测到，而流式细胞术只能检测10-4以上的残留[14]。随后，免疫组库高通量测序也被MalekFaham等人应用于B-ALLMRD检测的研究中，将ASO-PCR，流式细胞术和高通量检测技术做了对比，三种方式的检测结果具有很高的一致性，并且高通量测序的方法具有更高的分辨率，检测到更多的致病克隆[15，16]。同时，他们也用同样的方法验证了急性淋巴细胞白血病的基因的二次重排的假说，即致病的B细胞在完成V-D-J基因的重排后，又将原来的V基因用一个新的V基因替换掉，进化出新的致病克隆，使得白血病细胞的基因和表型有所改变，而这种改变会导致传统RQ-RCR无法检测到残留的白血病克隆。除了在检测MRD方面的应用外，免疫组库测序技术也被用来检测免疫重建的过程。AaronC.Logan等人，用高通量免疫组库测序技术来检测用造血干细胞移植的方法治疗的慢性淋巴细胞白血病的病人的免疫重建的过程，他们从诊断时一直检测到550天以上，发现在诊断时，病人的IGH基因图中中几乎全部是白血病克隆基因，在治疗后56天的时候白血病克隆的比例已经降低，但仍然存在，治疗后180天，白血病克隆完全消失，365天的时候病人的IGH基因图谱和健康人已经完全一样，预示着其免疫系统已经完全恢复[17]；并且可以通过检测到的白血病细胞残留情况预测预后效果，预测结果与临床结果一致[18]。
综上所述，用免疫组库高通量测序方法检测微小残留疾病，具有以下优点：无需针对患者设计特异PCR引物或探针，节省人力、时间等；操作简便，利于标准化，通量高，稳定性好；灵敏度高，可达到10-5数量级以上；检测整个抗原受体基因组变化情况，不会因为白细胞表面抗原表达的变化或白血病细胞的进化而漏检；动态监控患者免疫系统的变化情况及重建情况，提示预后效果。
参考文献：
[1]KwiecińskaK，BalwierzW，Moryl-BujakowskaA，etal.Long-termobservationsofchildrenwithacutelymphoblasticleukemiaandhighleukocytosistreatedaccordingtomodified“NewYore”protocols（1987-2003）[J].PrzeqlLek，2010，67（6）：350-354.
[2]SchrappeM，ValsecchiMG，BartramCR，etal.LateMRDresponsedeterminesrelapseriskoverallandinsubsetsofchildhoodT-cellALL：resultsoftheAIEOP-BFM-ALL2000study[J].Blood，2011，118：2077-2084.
[3]AthaleUH，GibsonPJ，BradleyNM，etal.MinimalResidualDiseaseandChildhoodLeukemia：StandardofCareRecommendationsFromthePediatricOncologyGroupofOntarioMRDWorkingGroup[J].PediatrBloodCancer.2016.63（6）：973-82.
[4]BatiaStark，SmadarAvigad，DroritLuria，etal.BoneMarrowMinimalDisseminatedDisease（MDD）andMinimalResidualDisease（MRD）inChildhoodT-CellLymphoblasticLymphomaStageIII，DetectedbyFlowCytometry（FC）andReal-TimeQuantitativePolymeraseChainReaction（RQ-PCR）[J].PediatrcBloodCancer，2009，52：20-25.
[5]SchusterSC.Next-generationsequencingtransformstoday'sbiology[J].Naturemethods，2008，5（1）：16-18.
[6]KotrovaM，MuzikovaK，MejstrikovaE，etal.Thepredictivestrengthofnext-generationsequencingMRDdetectionforrelapsecomparedwithcurrentmethodsinchildhoodALL[J].Blood.2015.126（8）：1045-1047.
[7]刘莉扬.高通量测序技术在临床医学中的应用进展[J].医学综述，2013，19（16）：2971-2973.
[8]BruggemannM，vanderVeldenVH，RaffT，etal.RearrangedT-cellreceptorbetagenesrepresentpowerfultargetsforquantificationofminimalresidualdiseaseinchildhoodandadultT-cellacutelymphoblasticleukemia[J].Leukemia，2004，18：709-719.
[9]FlohrT，SchrauderA，CazzanigaG，etal.Minimalresidualdisease-directedriskstratificationusingreal-timequantitativePCRanalysisofimmunoglobulinandT-cellreceptorgenerearrangementsintheinternationalmulticentertrialAIEOP-BFMALL2000forchildhoodacutelymphoblasticleukemia[J].Leukemia，2008，22：771-782.
[10]BriscoMJ，LathamS，SuttonR，etal.DeterminingtherepertoireofIGHgenerearrangementstodevelopmolecularmarkersforminimalresidualdiseaseinB-lineageacutelymphoblasticleukemia[J].JMolDiagn，2009，11：194-200.
[11]BoydSD，MarshallEL，MerkerJD，etal.MeasurementandclinicalmonitoringofhumanlymphocyteclonalitybymassivelyparallelVDJpyrosequencing[J].SciTranslMed，2009，1：12-23.
[12]WarrenEH，MatsenFAt，ChouJ，etal.High-throughputsequencingofB-andT-lymphocyteantigenreceptorsinhematology[J].Blood，2013，122：19-22.
[13]LoganAC，VashiN，FahamM，etal.ImmunoglobulinandTCellReceptorGeneHigh-ThroughputSequencingQuantifiesMinimalResidualDiseaseinAcuteLymphoblasticLeukemiaandPredictsPost-TransplantationRelapseandSurvival[J].BiolBloodMarrowTransplant.2014，doi：10.1016/j.bbmt.2014.04.018.
[14]WuD，SherwoodA，FrommJR，etal.High-throughputsequencingdetectsminimalresidualdiseaseinacuteTlymphoblasticleukemia[J].SciTranslMed，2012，4：134-163.
[15]FahamM，ZhengJ，MoorheadM，etal.Deep-sequencingapproachforminimalresidualdiseasedetectioninacutelymphoblasticleukemia[J].Blood，2012，120：5173-5180.
[16]GawadC，PepinF，CarltonVE，etal.MassiveevolutionoftheimmunoglobulinheavychainlocusinchildrenwithBprecursoracutelymphoblasticleukemia[J].Blood，2012，120：4407-4417.
[17]LoganAC，GaoH，WangC，etal.High-throughputVDJsequencingforquantificationofminimalresidualdiseaseinchroniclymphocyticleukemiaandimmunereconstitutionassessment[J].ProcNatlAcadSciUSA，2011，108：21194-21199.
[18]LoganAC，ZhangB，NarasimhanB，etal.Minimalresidualdiseasequantificationusingconsensusprimersandhigh-throughputIGHsequencingpredictspost-transplantrelapseinchroniclymphocyticleukemia[J].Leukemia，2013，27：1659-1665.