论文摘要
VEGF是1989年Ferrara等在牛垂体滤泡星状细胞体外培养液中首先纯化出来的糖蛋白，它是内皮细胞的特异性有丝分裂原，也是一种有效的血管形成和通透性诱导因子。VEGF与血管内皮细胞的相应受体结合，刺激血管内皮细胞的增殖，同时还可以促进血管内物质的泄露，为血管内皮细胞的迁移和肿瘤细胞的转移提供基质。VEGF在胃肠道原发腺癌、肾癌、乳腺癌、肺癌等许多肿瘤组织中高表达，并提示VEGF的表达与肿瘤细胞存活、侵袭转移和血管生成密切相关。鼻咽癌是我国南方常见的恶性肿瘤之一。鼻咽癌临床病理特点为低度分化和高转移性，以颈部淋巴结为首发症状就诊的病例可高达78.9％，而转移的发生是影响病人预后的主要因素。前人研究发现，在鼻咽癌及鼻咽癌颈部淋巴转移组织中VEGF明显高于慢性鼻咽炎组织，表明VEGF可能在鼻咽癌的生长及转移中发挥重要作用。因此阐明VEGF在鼻咽癌转移机制中的作用具有非常重要的意义。现已明确环：境因素和遗传因素协同作用是鼻咽癌发病的主要原因。在环境因素方面，EB病毒与鼻咽癌的相关性已得到肯定。EB病毒编码EBNA1、EBNA2、EBNA3A、EBNA3C和潜伏膜蛋白质（latent membrane protein 1,LMP1）等各种瘤蛋白。其中LMP1是一个重要的致瘤蛋白，它通过其羧基端胞浆区介导几条重要的细胞内信号通路的异常激活。其中LMP1的CTAR3（carboxyterminal activatingregion 3）参与活化JAK／STAT通路。我们前期的研究初步表明LMP1可以诱导VEGF的表达，增强STAT3在VEGF启动子区-848位的结合能力。STAT3是一个受EB病毒LMP1调控的重要的转录因子，在其靶向的多种下游基因中，VEGF是一个重要的靶基因，从而为建立LMP1—STAT3—VEGF之间的内在联系提供了有意义的实验依据。在此基础上我们进一步研究LMP1诱导VEGF表达的作用机制。我们前期工作进一步证明了LMP1依靠CTAR2、CTAR3的协同作用，通过JAK3促进酪氨酸705位STAT3磷酸化；并通过MAPK／ERK信号通路促进丝氨酸727位STAT3磷酸化，LMP1调控STAT3核移位为705位Tyr磷酸化依赖性。LMP1还可以通过IL-6的自分泌上调STAT3的酪氨酸和丝氨酸磷酸化水平。我们的研究明确了EB病毒LMP1在JAK3，MAPK／ERK激酶活化中的功能，尤其是LMP1对STAT3调控的分子机制，为我们深入探讨LMP1诱导VEGF表达的作用机制提供了实验证据。基于以上前期研究的工作基础，我们确定了“在鼻咽癌细胞中EB病毒LMP1通过JAK／STAT和MAPK／ERK通路激活STAT3调控VEGF的分子机制研究”这一研究课题。我们以EB病毒LMP1上调STAT3磷酸化为基础，采用阻断为主的策略研究LMP1介导STAT3信号通路对VEGF的调控机制。我们选择了鼻咽癌细胞中LMP1表达阴性的CNE1细胞和稳定表达LMP1的CNE1-LMP1细胞，根据LMP1调控STAT3信号通路的环节，从四个不同的层面来阻断STAT3信号通路。在LMP1层面，采用针对LMP1特异性的脱氧核酶DZ1阻断LMP1；在JAK3层面，采用JAK3特异性的小分子抑制剂WHI-P131阻断JAK3酪氨酸激酶活性；在ERK1／2层面，采用其上游激酶MEK1特异性小分子抑制剂PD98059阻断ERK1／2的丝氨酸激酶活性；在STAT3层面，采用直接针对STAT3的反义寡核苷酸（ASO）和干扰RNA阻断STAT3蛋白表达。我们采用western blotting技术来检测LMP1对STAT3磷酸化水平的调节，采用报告基因策略来观察JAK／STAT和MAPK／ERK通路对STAT的反式激活能力的影响。结果显示特异性靶向LMP1的脱氧核酶DZ1能显著抑制LMP1阳性鼻咽癌细胞中STAT3的磷酸化水平，而对STAT3总蛋白的表达没有影响，并且脱氧核酶能够有效地抑制LMP1诱导的STAT的反式激活能力；选择性JAK3抑制剂WHI-P131阻断JAK3／STAT信号通路的活化，呈剂量依赖性地抑制LMP1调控JAK3激酶激活的STAT3酪氨酸磷酸化水平，而STAT3丝氨酸磷酸化水平以及STAT3总蛋白表达不受影响，并且JAK3／STAT信号通路的阻断可以抑制STAT的反式激活能力；ERK上游激酶MEK1选择性抑制剂PD98059阻断ERK信号通路的活化后，呈剂量依赖性地抑制LMP1调控的ERK激酶激活的STAT3丝氨酸磷酸化水平，而STAT3酪氨酸磷酸化水平以及STAT3总蛋白表达不受影响，并且MAPK／ERK信号通路的阻断可以抑制STAT的反式激活能力，但其抑制程度弱于JAK3／STAT信号通路的阻断后的抑制程度。无论是在CNE1还是CNE1-LMP1细胞中，转染针对STAT3的siRNA100nm，72小时后，STAT3总蛋白表达被抑制，磷酸化STAT3水平也被抑制。针对STAT3的特异性反义寡核苷酸以序列特异性的方式抑制CNE1和CNE1-LMP1细胞系STAT3蛋白的表达，磷酸化STAT3水平也被显著地抑制。这样，我们进一步证实了STAT3是一个受LMP1调控的重要的转录因子。LMP1不仅调控STAT3的磷酸化，而且调节STAT的反式激活能力。并且进一步验证了在LMP1调控下，JAK3介导的STAT3活化主要是酪氨酸705位；而MAPK／ERK则通过介导STAT3丝氨酸727位磷酸化位点活化STAT3。肿瘤细胞分泌的VEGF选择性作用于血管内皮细胞膜上的VEGFR，VEGF及其受体通过旁分泌途径，联合调控内皮细胞分化和血管形成。因此，分泌到细胞外的VEGF是VEGF发挥作用的功能形式。在明确LMP1调控STAT3的磷酸化和反式激活能力的基础上，我们进一步从四个层面阻断LMP1、JAK3、MEK1、STAT3来观察VEGF的表达和分泌。我们采用Westem Bloaing技术和ELISA方法研究发现特异性靶向LMP1的脱氧核酶能够抑制鼻咽癌细胞中LMP1上调的VEGF蛋白表达和分泌。针对STAT3信号通路酪氨酸激酶JAK3的阻断剂WHI-P131能显著抑制LMP1诱导的VEGF蛋白的表达和分泌，且随着WHI-P131浓度的增加，呈明显的量效关系。针对STAT3信号通路丝氨酸激酶MEK1的阻断剂PD98059能显著抑制LMP1诱导的VEGF蛋白的表达和分泌，且随着PD98059浓度的增加，呈明显的量效关系。转染针对STAT3的siRNA和反义寡核苷酸后，不仅STAT3总蛋白表达被抑制，STAT3下游靶基因VEGF的表达和分泌也分别被抑制。我们的实验证明了LMP1介导的STAT3信号通路不仅可以上调VEGF的表达，而且可以促进VEGF分泌到细胞外发挥作用。因此我们确定了在LMP1表达阳性的鼻咽癌细胞中，存在信号转导通路，证实LMP1在VEGF功能性活化中的病理生理学意义。为进一步探讨STAT3信号通路在鼻咽癌细胞侵袭、转移中的作用机制。我们利用划痕实验，证实LMP1调控的STAT3信号通路被干扰后，鼻咽癌细胞的运动能力减弱，结合前面的研究结果提示LMP1可能通过STAT3信号通路的激活促进鼻咽癌细胞的侵袭转移。这对于阐明LMP1作为致瘤蛋白在鼻咽癌侵袭与转移中的分子机制提供了新的实验依据。结合上述的研究结果，我们认为LMP1可通过JAK3和ERK上调STAT3的磷酸化水平和STAT的反式激活能力，促使STAT3入核后，反式激活VEGF的启动子，促进VEGF的表达和分泌，在鼻咽癌细胞侵袭转移中发挥重要作用。本研究对进一步阐明鼻咽癌发生发展规律，选择STAT3作为新的治疗靶点奠定了有意义的理论基础。