hstK基因家族的pkn44和pkn30在鱼腥蓝细菌PCC 7120异形胞特异性糖脂合成中的作用

论文摘要

鱼腥蓝细菌PCC 7120是一种丝状蓝细菌,在培养基中缺乏化合态氮源的条件下,其菌丝上约5-10%的细胞会分化成异形胞。异形胞为生物固氮提供场所,并将固定的氮源传递给临近的营养细胞,以维持整条菌丝的生长。由于氧气可以使固氮酶不可逆失活,异形胞采取了3种措施来创造无氧环境,以保护固氮酶:首先,其胞外覆盖有由外层的多糖层和内层的糖脂层组成的包被,以限制氧气的进入;其次,异形胞不具有完整的PSⅡ,丧失了光合放氧的能力;此外,异形胞内的呼吸作用大大加强。异形胞的分化过程分为不同的阶段并且经历了复杂的形态变化,大量信号传导相关的蛋白质参与其中。在鱼腥蓝细菌PCC 7120中,存在一类命名为hstK的基因家族,拥有13个成员。该家族的特点是,在其编码蛋白质的氨基端具有一个丝氨酸/苏氨酸激酶结构域,而羧基端具有一个组蛋白激酶结构域。在本研究中,对hstK基因家族的2个成员pkn44和pkn30的功能进行了探讨。pkn44和pkn30的双突变体D4.3不能在缺乏化合态氮源的条件下维持生长,在缺氮诱导24hr时,观察不到异形胞的分化,而在缺氮诱导48hr时,可以观察到一些以异形胞模式分布的细胞,这些细胞可以被使异形胞特异性多糖着色的阿尔新蓝染色（Het+表型）。这表明,D4.3的异形胞发育出现了延迟并停滞在了较早的阶段。乙炔还原法测定固氮酶活性结果表明,在环境中存在氧气时,D4.3丧失了固定N2的能力;但是,当环境处于微氧状态时,D4.3能够表现出微弱的固氮酶活性（Fix+表型）。Western Blotting结果与固氮酶活性测定结果一致,在有氧条件下,D4.3中检测不到NifH的存在,只有在微氧条件下,才能在D4.3中检测到少量的NifH。RT-PCR和实时定量RT-PCR结果也显示,D4.3中只有在微氧条件下才能检测到微弱的nifH的转录。这些结果暗示,D4.3仍具有转录并表达NifH的能力,它在有氧条件下表现出来的种种异常很有可能是受到高水平细胞内氧气浓度的侵害,换而言之,D4.3分化出的不成熟的异形胞可能并不具备有效隔离氧气的能力。对D4.3的电子显微镜观察结果支持这一推论,在D4.3的异形胞外,没有观察到完整的异形胞包被,本应位于内层的糖脂层并不存在,而外层的多糖层也较野生型稀薄。薄层层析分析表明,D4.3只能合成异形胞特异性糖脂中的1-（α-D-葡萄糖）-3,25-二十六烷基二醇而不能合成1-（α-D-葡萄糖）-3-酮基-25-二十六烷醇。随后通过RT-PCR和实时定量RT-PCR对D4.3中部分糖脂相关基因的转录进行了检测,结果表明,这些基因的转录在D4.3中受到了不同程度的影响。在鱼腥蓝细菌PCC 7120中,prpJ也是一个只参与一种异形胞特异性糖脂合成的基因,它编码PP2C类蛋白磷酸酶。其突变体可以合成1-（α-D-葡萄糖）-3-酮基-25-二十六烷醇,而不能合成1-（α-D-葡萄糖）-3,25-二十六烷基二醇。prpJ2是prpJ的同源基因,同样编码一个PP2C类蛋白磷酸酶。prpJ2的突变并不影响菌体在缺氮条件下的生长和异形胞分化,但是,prpJ2和prpJ同时突变的双突变体S19/S20丧失了分化异形胞的能力。实时定量RT-PCR结果显示,prpJ2在缺氮后上调表达,而这种上调表达在ntcA突变体中观察不到,这暗示,prpJ2可能处于NtcA的调控之下。EMSA实验结果支持这一推论,在prpJ2编码区上游发现的NtcA结合位点可以在体外与NtcA相结合。此外,实时定量RT-PCR结果表明,突变体S19/S20中hetR的表达量在缺氮后不能维持上调表达,这有可能是其不能分化异形胞的原因。因此,PrpJ2可能参与了异形胞的早期发育。hanA编码组蛋白类似蛋白,其突变体不能分化异形胞。在本研究中发现,hanA的异位表达会导致异形胞的异常分化。研究还发现,在缺氮诱导24hr后,hanA的表达量在野生型中上调,而在ntcA突变体中hanA的表达量仍和诱导前持平。EMSA实验也证实,hanA编码区上游的NtcA结合位点可以与NtcA结合。这些结果暗示hanA可能直接受到NtcA的调控。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语表
• 1.文献综述
• 1.1 鱼腥蓝细菌PCC 7120的异形胞发育调控
• 1.1.1 鱼腥蓝细菌PCC 7120简介
• 1.1.2 异形胞的特点
• 1.1.3 异形胞的发育
• 1.1.3.1 异形胞发育的起始
• 1.1.3.2 异形胞发育的早期调控和模式建立
• 1.1.3.2.1 异形胞发育早期的关键基因
• 1.1.3.2.2 异形胞发育的调控网络和模式形成
• 1.1.3.3 参与异形胞分化的其它基因
• 1.1.3.4 其它影响异形胞分化模式的因素
• 1.1.3.5 组蛋白类似蛋白HU在异形胞分化过程中可能的作用
• 1.1.3.5.1 大肠杆菌中的HU蛋白
• 1.1.3.5.2 鱼腥蓝细菌PCC 7120中的HU蛋白
• 1.1.4 异形胞包被形成
• 1.1.4.1 鱼腥蓝细菌PCC 7120异形胞特异性多糖合成相关基因
• 1.1.4.2 鱼腥蓝细菌PCC 7120异形胞特异性糖脂成分及合成途经
• 1.1.4.2.1 鱼腥蓝细菌PCC 7120异形胞特异性糖脂成分
• 1.1.4.2.2 鱼腥蓝细菌PCC 7120异形胞特异性糖脂合成途径
• 1.1.4.2.3 异形胞特异性糖脂合成及调控相关基因
• 1.1.5 固氮酶行使功能
• 1.1.5.1 固氮酶系统
• 1.1.5.2 异形胞特异性染色体重排
• 1.1.5.3 固氮酶基因表达的调控
• 1.1.5.4 适合固氮酶系统行使功能的环境
• 1.2 信号传导系统简介
• 1.2.1 双组分信号传导系统
• 1.2.1.1 组蛋白激酶
• 1.2.1.2 反应调控蛋白
• 1.2.2 丝氨酸/苏氨酸和酪氨酸激酶与蛋白磷酸酶
• 1.2.2.1 丝氨酸/苏氨酸和酪氨酸激酶
• 1.2.2.2 蛋白磷酸酶
• 1.3 鱼腥蓝细菌PCC 7120中的信号传导系统
• 1.3.1 蓝细菌中的信号传导系统
• 1.3.2 鱼腥蓝细菌PCC 7120中的信号传导系统简介
• 1.3.3 鱼腥蓝细菌PCC 7120中的双组分信号转导系统
• 1.3.4 鱼腥蓝细菌PCC 7120中的丝氨酸/苏氨酸和酪氨酸激酶与蛋白磷酸酶
• 1.3.4.1 鱼腥蓝细菌PCC 7120中的丝氨酸/苏氨酸和酪氨酸激酶
• 1.3.4.2 鱼腥蓝细菌PCC 7120中的蛋白磷酸酶
• 1.3.4.3 HstK家族
• 1.4 研究目的与意义
• 2.材料与方法
• 2.1 菌株和质粒
• 2.2 培养基配方以及培养条件
• 2.3 主要分子生物学试剂
• 2.4 实验方法
• 2.4.1 质粒DNA的制备及其基本操作
• 2.4.2 质粒DNA的其它有关操作
• 2.4.3 粘性末端的平端化
• 2.4.4 转化
• 2.4.4.1 大肠杆菌的常规转化
• 2.4.4.2 大肠杆菌表达宿主细胞的转化
• 2.4.5 大肠杆菌超表达外源蛋白质的纯化
• 2.4.6 EMSA（Electrophoretic Mobility Shift Assay）
• 2.4.7 鱼腥蓝细菌异形胞的诱导
• 2.4.8 鱼腥蓝细菌PCC 7120总DNA的抽提
• 2.4.9 蓝细菌结合转移（三亲本杂交）
• 2.4.10 接合转移转化子的验证
• 2.4.11 固氮酶活性的测定
• 2.4.12 鱼腥蓝细菌RNA提取和纯化
• 2.4.13 RT-PCR和Real-Time RT-PCR
• 2.4.13.1 RNA定量和浓度调整
• 2.4.13.2 半定量反转录PCR（RT-PCR）
• 2.4.13.3 实时定量反转录PCR（Real-Time RT-PCR）
• 2.4.14 鱼腥蓝细菌PCC 7120细胞中蛋白质的提取
• 2.4.15 蛋白定量——BradFord法
• 2.4.16 Western Blotting
• 3 结果与分析
• 3.1 pkn44和pkn30参与了鱼腥蓝细菌PCC 7120异形胞特异性糖脂1-（α-D-葡萄糖）-3-酮基-25-二十六烷醇的合成
• 3.1.1 突变体D4.3
• 3.1.2 突变体D4.3在缺氮环境中的生长曲线和异形胞发育
• 3.1.3 突变体D4.3缺氮诱导后HetR表达量的变化
• 3.1.4 突变体D4.3在不同条件下的固氮酶活性
• 3.1.5 突变体D4.3中nifD因子重排的检测
• 3.1.6 突变体D4.3中不同条件下NifH的表达水平
• 3.1.7 突变体D4.3在不同条件下nifH的转录水平
• 3.1.8 突变体D4.3的超微结构
• 3.1.9 突变体D4.3异形胞特异性糖脂分析
• 3.1.10 突变体D4.3中糖脂合成相关基因的转录
• 3.1.11 突变体D4.3中多糖合成相关基因hepK和hepA的转录
• 3.1.12 对突变体D4.3的遗传互补
• 3.2 PrpJ2参与了鱼腥蓝细菌PCC 7120的异形胞分化
• 3.2.1 NtcA蛋白对prpJ2启动子片段的结合
• 3.2.1.1 NtcA蛋白质的纯化
• 3.2.1.2 NtcA蛋白对prpJ2启动子片段的结合
• 3.2.2 prpJ2在缺氮诱导后的转录水平
• 3.2.3 S19/S20中hetR的转录水平
• 3.3 组蛋白类似蛋白HU参与了鱼腥蓝细菌PCC 7120的异形胞分化
• 3.3.1 组蛋白类似蛋白HU（HanA）在鱼腥蓝细菌PCC 7120中的定位
• 3.3.2 异位表达HanA对异形胞分化的影响
• 3.3.3 NtcA蛋白对hanA启动子片段的结合
• 3.3.4 hanA在缺氮诱导后的转录水平
• 3.3.5 NtcA与hanA启动子相互作用的体外实验
• 4 讨论与展望
• 4.1 HstK家族的功能
• 4.2 异形胞特异性糖脂合成的调控
• 4.3 PrpJ2在异形胞的早期发育中的作用
• 4.4 组蛋白类似蛋白HU在异形胞早期发育中所受的调控
• 4.5 小结
• 参考文献
• 附录 本研究所用引物
• 博士期间主要学术成果
• 致谢