苏云金芽孢杆菌营养期杀虫蛋白基因Vip3Aa在虫生真菌球孢白僵菌中的表达

论文摘要

球孢白僵菌作为最为常见的虫生真菌，寄主范围广，且易于大量生产，在自然环境中有时能在寄主种群中形成流行病，有利于抑制虫口的大发生。但由于其对害虫的致死时间较长、对环境条件要求又高，所以球孢白僵菌杀虫剂应用的广泛性受到限制。利用基因工程技术提高菌株毒力是当今世界上关注的研究热点。本文以球孢白僵菌Bb13和Bb1944作为出发菌株，分别引入苏云金杆菌的营养期杀虫蛋白基因Vip3Aa，构建了两个转基因工程菌株。根据苏云金杆菌营养期杀虫蛋白基因Vip3Aa序列设计全基因扩增引物，并在引物两端添加合适的酶切位点EcoRI和XhoI，对目的基因进行PCR扩增，将纯化的PCR产物和含有筛选标记bar基因的载体pbarGPE1质粒分别进行XhoI和EcoRI双酶切，再次纯化，然后，将两者的纯化物进行连接，构建成真菌表达载体pbarGPE1-vip3Aa。将构建好的质粒经ScaI酶切线性化后，利用芽生孢子转化法转入虫生真菌球孢白僵菌Bb13和Bb1944菌株内，得到白僵菌工程菌株Bb13V和Bb1944V。RT-PCR结果证明Vip3Aa在两个工程菌株中均能得到成功转录。在室内恒温25℃条件下，用喂食、喷雾以及两者相结合的方法，分别测定1×105、1×106、1×107、1×108和2×108孢子/ml五个不同孢子浓度下Bb13和Bb1944的原始菌株和工程菌株对二龄马尾松毛虫和玉米螟的毒力，将测定结果用DPS进行数据分析。对松毛虫测定的结果表明，在2×108孢子/ml孢子浓度下，工程菌株和非工程菌株间致死率差异不大。在1×105、1×106、1×107和1×108孢子/ml四个不同孢子浓度下处理条件下，采取3种不同的处理方式，工程菌株均原始菌株致死率提高30%以上；喷雾处理的毒力提高33.662.1倍；喂食处理组的致死率均高于喷雾处理。在所有处理中，喂食和喷雾相结合的处理组致死率最高。在1×108孢子/ml浓度下，喂食处理的致死率显著高于喷雾处理，致死中时缩短6.89d。对玉米螟测定的结果表明，工程菌株各处理组均比原始菌株的死亡率高；喷雾处理的毒力提高了50.578.1倍；在2×108孢子/ml浓度下，喷雾组的致死中时（4.84）比原始菌株（6.42）缩短了1.58d。两个菌株的毒力测定都说明Vip3Aa基因在转入白僵菌后得到了表达，使得工程菌对松毛虫和玉米螟的毒力明显增强。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 文献综述
• 1.1 发展生物源农药的必要性
• 1.2 真菌杀虫剂的发展简史
• 1.3 虫生真菌的致病机理
• 1.4 提高虫生真菌毒力的研究
• 1.5 虫生真菌的遗传转化方法
• 1.5.1 PEG/原生质体转化法
• 1.5.2 芽生孢子转化法
• 1.5.3 电击转化法
• 1.5.4 基因枪转化法
• 1.5.5 农杆菌介导转化法
• 1.6 几种与毒力有关的活性物质的研究现状
• 1.7 Bt杀虫蛋白的研究进展
• 1.8 转Bt毒力基因白僵菌的研究应用前景
• 1.9 总结与展望
• 2 引言
• 3 材料与方法
• 3.1 材料
• 3.1.1 供试菌株
• 3.1.2 供试质粒
• 3.1.3 主要的培养基
• 3.1.4 主要的化学试剂
• 3.1.5 常用的缓冲液和贮藏液
• 3.1.6 主要的仪器设备
• 3.2 方法
• 3.2.1 实验流程图
• 3.2.2 表达载体pbarGPE1-vip3A的构建
• 3.2.3 芽生孢子法转化球孢白僵菌Bb13 和Bb1944
• 3.2.4 生物测定
• 4 结果与分析
• 4.1 Vip3Aa基因和启动子终止子序列的扩增验证
• 4.2 pbarGPE1-vip3Aa质粒的菌液PCR验证
• 4.3 pbarGPE1-vip3Aa 质粒的双酶切验证
• 4.4 转化球孢白僵菌芽生孢子
• 4.5 真菌转化子的验证
• 4.5.1 工程菌株Bb13V与Bb1944V转化子的PCR验证
• 4.5.2 工程菌株的RT-PCR验证
• 4.6 毒力的生物测定
• 4.6.1 Bb13V对松毛虫的毒力测定
• 4.6.2 Bb1944V对玉米螟的毒力测定
• 5 讨论
• 5.1 转Bt毒蛋白基因生物的研究
• 5.2 关于质粒载体构建
• 5.3 遗传转化方法的研究
• 5.4 白僵菌基因工程重组菌株的优越性以及依然存在的问题
• 6 小结
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介
• 在读期间投稿和发表的学术论文