鹅G蛋白偶联受体103（GPR103）基因克隆及其剪接变异体的发现与分析

论文摘要

G蛋白偶联受体103 （G protein-coupled receptor 103, GPR103）,又名QRFPR （pyroglutamylated RFamide peptide receptor）,属于G蛋白偶联受体（G protein-coupled receptors, GPRs）超家族A族的肽类。已有哺乳动物方面的研究表明,该基因可能在脂质代谢中发挥着重要的作用,然而,目前对禽类GPR103结构和功能尚缺乏研究,在哺乳动物中也不清楚该基因有多少种剪接变异体及各种剪接变异体的剪切方式。因此,本实验在前期构建的抑制消减杂交文库中筛选出的鹅GPR103表达序列标签序列的基础上,以四川白鹅为实验材料,分别从mRNA和DNA水平研究了鹅GPR103序列以及存在的不同剪接变异体和剪接方式,为深入研究该基因的功能及表达调控奠定了良好基础。主要研究结果如下：（1）利用RT-PCR、RACE、克隆测序以及序列拼接,首次得到鹅GPR103的5种不同剪接变异体的完整序列,分别命名为gGPR103-α、gGPR103-b、gGPR103-c、gGPR103-d和gGPR103-e。同时获得了6条该基因3’端EST序列,分别命名为gGPR103-I4A、gGPR103-I4B、gGPR103-I4C、gGPR103-15A、gGPRl 03-E6A和gGPR103-E6B。（2）以所获得的鹅GPR103外显子序列为基础,通过PCR和克隆测序获得了该基因的内含子序列,经过序列拼接,获得鹅GPR103部分DNA序列,长7002 bp。（3）将所获得的鹅GPR103各种剪接变异体与该基因DNA序列进行比较,发现GPR103各剪接位点均符合GU-AG规则,且具有2种选择性剪接方式。其中gGPR103-b、gGPR103-c属于外显子跳跃型,gGPR103-d、gGPR103-e属于3’剪接位点的选择性使用,gGPR103-d中出现了外显子获得。（4）研究发现,鹅GPR103至少存在7种不同类型的选择性加尾方式。gGPR103-α、gGPR103-b、gGPR103-c、gGPR103-d、gGPR103-e具有完全相同的3’端,属于同一类加尾方式；其余6条EST均具有完整的3’尾巴结构,但3’端序列具有很大的差异,分别属于不同的加尾方式。（5）鹅GPR103的选择性剪接导致了剪接变异体结构与功能的改变。gGPR103-a具有GPR超家族的7次跨膜结构,既包括GPR超家族的结构域,又具有Aa-Trans超家族的结构域；gGPR103-b、gGPR103-c、gGPR103-d、gGPR103-e发生提前终止,分别跨膜4次、3次、5次和5次,其中gGPR103-b、gGPR103-e只具有Aa-Trans超家族的结构域,gGPR103-c、gGPR103-d只具有GPR超家族的结构域。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 目录
• 1 前言
• 1.1 G蛋白偶联受体
• 1.1.1 GPRs的结构与功能
• 1.1.2 GPRs的可调控性
• 1.2 G蛋白偶联受体103
• 1.3 选择性剪接
• 1.3.1 选择性剪接的普遍性
• 1.3.2 选择性剪接的多样性
• 1.3.3 选择性剪接的调控性
• 1.3.4 选择性剪接的特异性
• 1.4 本研究的目的意义
• 2 材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 样本的采集
• 2.1.2 主要仪器设备
• 2.1.3 主要试剂及试剂盒
• 2.1.4 主要试剂的配制
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 逆转录PCR获取鹅GPR103 mRNA部分序列
• 2.2.2 利用RACE获取鹅GPR103 mRNA完整序列
• 2.2.3 GPR103内含子序列的扩增
• 2.2.4 结果分析的主要工具和软件
• 3 结果与分析
• 3.1 总RNA和基因组DNA的抽提结果
• 3.2 鹅GPR103 MRNA及EST序列
• 3.2.1 RT-PCR结果
• 3.2.2 RACE反应结果
• 3.2.3 序列拼接结果
• 3.3 鹅GPR103 DNA序列
• 3.4 鹅GPR103的选择性剪接
• 3.5 鹅GPR103的选择性加尾
• 3.6 鹅GPR103不同剪接变异体的保守结构域
• 3.7 鹅GPR03不同剪接变异体的跨膜结构域
• 4 讨论
• 4.1 鹅GPR103序列的获取
• 4.2 鹅GPR103的选择性剪接方式
• 4.3 鹅GPR103选择性剪接的顺式调控元件
• 4.4 鹅GPR103的选择性加尾
• 5 结论
• 主要参考文献
• 致谢
• 附录