启动子对hGM-CSF基因在鱼腥藻7120中表达影响的研究

论文摘要

蓝藻是一种可以进行放氧光合作用的原核生物。它具有结构简单、培养成本低、绝大多数不含毒素、营养丰富、分布广泛、环境适应能力强、便于外源基因转化、蛋白酶活性低等优点。这些优点使蓝藻有可能成为较大肠杆菌和酵母更为理想的基因工程宿主。随着蓝藻基因工程的发展,已有一批有应用前景的外源基因得到成功表达,使转基因蓝藻可以在医药和环保问题上得到应用。而人粒细胞—巨噬细胞集落刺激因子（hGM-CSF）是第一个被克隆和利用重组DNA技术生产的造血刺激因子,是一个具有多项潜能的造血生长因子,具有十分重要的临床应用价值,在国际生物技术制药市场上占有重要的位置。但是天然hGM-CSF因制备量少,纯度不够高等原因,远不能满足市场需要。因此,用基因工程来生产hGM-CSF有其重要的经济、社会意义以及独特的优越性。外源基因在蓝藻细胞中表达效率较低一直以来都是制约蓝藻基因工程长足发展的一个瓶颈。而影响蓝藻外源基因表达调控的关键就是转录和翻译水平上的调控,对基因转录效率起决定作用的是由RNA聚合酶与启动子之间相互作用所控制的起始过程,所以启动子的选择对外源基因的表达至关重要。因此,本研究根据鱼腥藻7120中RNA聚合酶的特性以及蓝藻内源启动子的结构性质,选用了两个蓝藻内源启动子Pcpcβ和PgroESL来起始转录表达外源基因hGM-CSF。运用PCR方法,从蓝藻中成功调出藻蓝蛋白β亚基基因启动子Pcpcβ和热休克基因启动子PgroESL,将外源基因插入到启动子的下游后进一步与穿梭表达载体pDC-08相连构建成两个穿梭表达载体pDC-C-GM和pDC-G-GM。利用三亲接合转移法转化到鱼腥藻7120中,通过相应抗生素筛选并经继代培养后得到能稳定遗传的含有目的基因和目的启动子的两个转基因藻cGM和gGM,并对转基因藻的最适生长条件进行了优化筛选。测定了转基因藻的生理活性、PCR及Western blotting的数据分析,以此来探测外源基因hGM-CSF在鱼腥藻7120中的表达效率。本论文的主要内容及结果如下:1.从聚球藻7002总DNA中克隆出了Pcpcβ启动子,然后从实验室中已构建好的pDC–GM载体中将被修饰的外源基因hGM-CSF经双酶切切下,将其插入到载体pUC-cpcβ的启动子Pcpcβ下游,最后将其连同启动子一起克隆到穿梭载体的pDC-08的相应位点,成功的构建了穿梭表达载体pDC-C-GM,并通过三亲接合转移方法转入鱼腥藻7120中,通过抗生素筛选及继代培养后,获得了转基因藻cGM。2.从聚球藻7942总DNA中克隆出了热休克启动子PgroESL,然后从实验室中已构建好的pDC–GM载体中将经修饰的外源基因hGM-CSF经双酶切切下,将其插入到载体pUC-groESL的启动子PgroESL下游,最后将其连同启动子一起克隆到穿梭载体的pDC-08的相应位点,成功的构建了穿梭表达载体pDC-G-GM,并通过三亲接合转移方法转入鱼腥藻7120中,通过抗生素筛选及继代培养后,获得了转基因藻gGM。3.对两种转基因藻进行了DNA水平检测,通过PCR方法,测定了转基因藻cGM基因组DNA中已稳定存在启动子Pcpcβ和外源基因hGM-CSF;转基因藻gGM基因组DNA中已稳定存在启动子PgroESL和外源基因hGM-CSF。4.对两种转基因藻进行了优化培养,在本实验设置的范围内,两种转基因藻cGM和gGM的适宜温度为30℃,适宜pH值为9.5,适宜光照强度为60--90μmol m-2·s-15.对两种转基因藻进行了Western blotting检测,表明在两种转基因藻中均表达了具有免疫活性的hGM-CSF。利用软件分析结果,证实Pcpcβ启动下的hGM-CSF比启动子PpsbA下的hGM-CSF表达量提高90%;证实PgroESL启动下的hGM-CSF经过高温热诱导后比PpsbA下的hGM-CSF表达量提高459%.以上结果证明,替换了启动子的目的基因hGM-CSF在鱼腥藻7120中的表达效率在一定程度上有了明显提高,尤其是热休克启动子PgroESL启动下的hGM-CSF经过热诱导后,表达量较PpsbA下的hGM-CSF提高了459%.为将来进一步利用蓝藻制备hGM-CSF基因药物的口服剂和研究如何提高外源基因在蓝藻中的表达作一些基础工作。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1 文献综述
• 1.1 蓝藻基因工程
• 1.1.1 蓝藻基因组概述
• 1.1.2 蓝藻基因工程载体
• 1.1.3 蓝藻外源基因的转化方法
• 1.1.4 蓝藻表达外源基因的研究进展
• 1.1.5 蓝藻中外源基因的表达调控与高效表达策略
• 1.2 人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（hGM-CSF）
• 1.2.1 hGM-CSF 的结构特点及生物学活性
• 1.2.2 hGM-CSF 的临床应用
• 1.2.3 hGM-CSF 的研究进展
• 1.3 本实验的研究内容、目的与意义
• 1.3.1 本研究的内容
• 1.3.2 本研究的目的与意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 质粒、菌株和蓝藻株
• 2.1.2 工具酶和试剂
• 2.1.3 主要仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 培养基的配制
• 2.2.2 蓝藻的培养、纯化、保种及扩大培养
• 2.2.3 目的基因的克隆
• 2.2.4 载体的构建
• 2.2.5 蓝藻的转化与筛选
• 2.2.6 转基因藻的DNA 检测
• 2.2.7 转基因藻的Western Blot 分析
• 2.2.8 转基因藻生理活性的检测
• 2.2.9 转基因藻培养条件的优化
• 3 结果与分析
• 3.1 Pcpcβ启动hGM-CSF 基因在鱼腥藻7120 中的表达与检测
• 3.1.1 穿梭表达载体pDC-C-GM 的构建
• 3.1.2 cGM 藻株的获得
• 3.1.3 cGM 藻株的检测
• 3.1.4 cGM 藻株培养条件的优化
• 3.1.5 cGM 藻株生理曲线的测定
• 3.2 PgroESL 启动hGM-CSF 基因在鱼腥藻7120 中的表达与检测
• 3.2.1 穿梭表达载体pDC-G-GM 的构建
• 3.2.2 gGM 藻株的获得
• 3.2.3 gGM 藻株的检测
• 3.2.4 gGM 藻株培养条件的优化
• 3.2.5 gGM 藻株生理曲线的测定
• 4 讨论
• 4.1 在鱼腥藻7120 中表达hGM-CSF 基因的可行性
• 4.1.1 利用基因工程手段制备 hGM-CSF 的必要性
• 4.1.2 利用鱼腥藻7120作为宿主表达hGM-CSF有一定的优越性
• 4.1.3 在鱼腥藻7120 中成功稳定地表达了hGM-CSF
• 4.2 转录水平上的调控对外源基因在蓝藻中表达的影响
• 4.2.1 启动子对外源基因表达效率的影响
• 4.2.2 PcpcB 及PgroESL 成功地提高了外源基因hGM-CSF 在7120 中的表达
• 4.2.3 替换启动子的外源基因hGM-CSF 的转入对转基因藻生长的影响
• 4.3 通过优化培养条件提高转基因藻的生长
• 4.3.1 不同温度条件对转基因藻生长的影响
• 4.3.2 不同pH 对转基因藻生长的影响
• 4.3.3 不同光照强度对转基因藻生长的影响
• 5 总结
• 5.1 克隆启动子PcpcB 及PgroESL 并构建穿梭表达载体pDC-C-GM 和pDC-G-GM
• 5.2 获得了两个转基因鱼腥藻 cGM 和 gGM 藻株并对其进行检测
• 5.3 转基因藻株培养条件的优化
• 5.4 展望
• 6 参考文献
• 附录
• 符号与缩写表
• 致谢