论文摘要
研究目的及背景骨髓间质干细胞（bone marrow derived Mesenchymal stem cells，骨髓MSCs）是骨髓内除造血干细胞（hematopoietic stem cells，HSC）之外的另一类干细胞，可以分化为骨、软骨、脂肪、甚至肌肉组织等各种间质组织。近年来在组织工程，细胞移植等方面有着很广泛的应用。而各种类型的心脏疾患在病程的某一阶段均有可能出现主要包括由Ⅲ°房室传导阻滞和病态窦房结综合症等引起的致命性缓慢型心律失常，对于该类心律失常的治疗研究，近年来有学者用干细胞构建生物起搏器或生物传导系统来治疗致命性缓慢型心律失常。本研究用兔骨髓MSCs，经5-氮胞苷诱导分化为心肌样细胞后，移植到自体兔心脏左房室交界处，构建房室间电传递新通道，并采用常规心脏电生理学方法进行检测。以期为以生物学方法部分或完全替代以往需用电起搏器处理的房室传导阻滞的治疗打下理论基础。材料与方法以新西兰大白兔为研究对象，从兔骨髓中分离、培养骨髓MSCs，并比较3种兔骨髓MSCs分离方法：不连续Percoll分离液密度梯度离心法、Ficoll密度梯度离心法、全血细胞培养方法；用不连续Percoll分离液密度梯度离心法分离兔骨髓MSCs，进行体外纯化和扩增培养；取原代培养72h及扩增第2、4、6代MSCs以5-氮胞苷诱导分化，倒置显微镜及电镜观察5-氮胞苷的诱导分化作用；用免疫细胞化学方法检测诱导后心肌细胞相关抗体的表达；用荧光标记物标记诱导后的MSCs，并移植到自体兔心脏左房室交界处，构建房室间电传递新通道。采用常规心脏电生理学方法对房室间电传递新通道是否形成及其电生理特性进行检测，包括检测在Ⅲ°房室传导阻滞模型下房室间电传递新通道的电生理特性；并采用组织病理学以及免疫组织化学等技术观察心脏细胞移植区、移行区的组织功能结构特点。结果3种兔骨髓MSCs分离方法中，不连续Percoll分离液密度梯度离心法在各项指标中均优于Ficoll密度梯度离心法及全血细胞培养方法，且成功率最高。第2、4、6代骨髓MSCs经5-氮胞苷诱导后14d，相差显微镜下见细胞融合呈长梭形排列，有明显方向性，24d可见肌管样结构；免疫组化检测发现：第2、4、6代骨髓MSCs诱导后均表达α—横纹肌肌动蛋白，且第4代骨髓MSCs表达α—横纹肌肌动蛋白的阳性细胞较第2、6代多；透射电镜下可见肌丝及原始肌节结构；原代培养72h细胞，经诱导后无阳性结果。DAPI标记的诱导后骨髓MSCs心肌移植后，用常规心脏电生理学方法未能检测到房室间电传递新通道的形成，免疫组织化学方法可在移植部位检测到移植的骨髓MSCs。结论（1）对于成年兔穿刺获取骨髓MSCs，不连续Percoll分离液密度梯度离心法是最适合的分离方法；（2）兔骨髓MSCs经5-氮胞苷诱导可定向分化为心肌样细胞；传代培养的MSCs中，MSCs的数量、扩增能力是定向诱导分化为心肌样细胞的基本条件；（3）诱导分化后骨髓MSCs可在兔心肌移植部位生长，但用常规心脏电生理学方法未能检测到有房室间电传递新通道的形成。