论文摘要
作为植物体内促进生长的一种激素,生长素被其受体TIR1/AFB1/AFB2/AFB3所感知,促进了抑制因子AUX/IAAs的降解,从而解除了AUX/IAAs对于Auxin response factors（ARFs）的抑制作用,ARFs作为转录因子可以结合到下游基因的启动子上,启动下游反应。拟南芥AUX/IAAs家族有29个成员,对于该家族的研究主要集中在功能获得性突变体方面。本文选取AtIAA15作为研究对象,通过超表达和抑制表达两方面实验来研究该基因在植物发育以及生长素信号途径中的作用。获得的主要结论有：1.AtIAA15超表达株系的表型AtIAA15超表达株系表现出植物生长发育的一系列缺陷,主要有植株瘦弱矮小,顶端优势不明显,育性降低,角果短小褶皱。对地下部分的观察表明,超表达株系的向重力性部分丢失,根分生区长度变短,主根变短,根干细胞槽的分化受到了抑制,表现在淀粉粒染色实验时成熟的根冠细胞层数的减少。2.超表达AtIAA15对于生长素信号途径的影响上述AtIAA15超表达株系的发育方面的表型与生长素信号途径受到抑制后的表型比较类似,将AtIAA15超表达株系与生长素信号途径的标记株系DR5::GUS杂交,通过对杂交后代的分析表明生长素在根尖的积聚变多,同时生长素在根的伸长区的积累变多,暗示由茎向根的生长素的极性运输Polar Auxin Transport（PAT）可能受到影响。进一步将AtIAA15超表达株系与PAT相关标记株系PIN1pro::PIN1-GFP, PIN2pro::PIN2-GFP, PIN3pro::PIN3-GFP, PIN7pro::PIN7-GFP以及AUX1pro::AUX1-YFP杂交,对于杂交后代的激光共聚焦显微镜（confocal）分析显示PIN2-GFP,PIN3-GFP,PIN7-GFP,AUX1-YFP在超表达株系中降低明显,而PIN1-GFP没有明显变化。3.超表达AtIAA15对于根干细胞发育相关调控因子的影响在拟南芥中,根干细胞槽的发育受到生长素和一系列转录因子的调控,其中最重要的是WUSCHEL-RELATED HOMEOBOX5（WOX5）和PLETHORA （PLT） AP2-domain transcription factors这两种转录因子。将AtIAA15超表达株系与相关标记株系PLT1pro::CFP（影响干细胞发育的重要转录因子）,WOX5pro::GFP（标记静止中心Quiescent Center,QC）, J2341（标记静止中心QC和根冠干细胞columella stem cell,CSC）杂交。通过对杂交后代分析显示：WOX5pro::GFP在超表达突变体中出现异位表达,暗示静止中心区域扩大。J2341荧光强度变弱,可以观察到两层以上的根冠干细胞,暗示根冠干细胞向根冠细胞的分化受到阻碍。PLT1pro::CFP荧光强度降低明显。4.AtIAA15下游靶基因的鉴定ARFs家族有23个成员,将ARFs的部分或者全长cDNA构建到载体pGADT7中,将AtIAA15全长cDNA构建到载体pGBKT7中,通过酵母双杂交验证表明,AtIAA15潜在的靶基因是ARF5和ARF6。5. AtIAA15的表达模式分析通过PCR将AtIAA15启始密码子ATG上游约2.4kb的基因组序列扩增后连接到GUS载体pBI101.2并转化拟南芥。对获得的转基因植株的染色分析显示,AtIAA15的表达集中在茎尖和根尖分生组织,在侧根起始位置,成熟侧根的根尖,叶脉以及柱头也有表达。10μmol/L IAA处理显示,AtIAA15的表达在12h和24h都受到大量诱导。通过GFP-IAA15融合蛋白分析发现,IAA15蛋白定位在细胞核中。