RNA干扰Bcl-2对人卵巢癌细胞增殖抑制作用的研究

论文摘要

Bcl-2 作为一种抗凋亡蛋白基因,可保护细胞免于病毒、氧化剂等刺激诱导的细胞凋亡。Bcl-2 蛋白的高表达是肿瘤发生和产生耐药性的重要原因之一。因此,利用 RNA 技术,通过抑制 Bcl-2 蛋白基因的病毒,达到促进肿瘤细胞凋亡的目的,是目前正积极探索的一条新的肿瘤治疗途径。 RNAi 是一种从低等生物到哺乳动物都有的保守的防御反应。双链RNA 在细胞内被 RNA 酶Ⅲ（Ribonuclase Ⅲ, RNaseⅢ）酶切成约2123nt 的小片断干扰 RNA （short interfering RNA, siRNA）,进而形成 siRNA-蛋白复合物,即 RNA 诱导沉默复合体（RNA-inducedsilencing complex, RISC）。RISC 通过识别、降解具有同源序列的信使 RNA（messenger ribonucleicacid, mRNA）,最终导致特异性的基因表达沉默（gene silencing）[1]。本研究通过自行构建能在细胞内转录出功能性 siRNA 的载体,并将其用于干扰抗凋亡基因 Bcl-2 的表达,为下一步基因功能和治疗手段的研究奠定基础。 第一部分:重组质粒载体的构建 目的:RNAi 是近年广泛应用的新技术,它能明显抑制目的基因的表达。靶 Bcl-2 基因的 siRNA 与具有荧光蛋白表达的 pGenesil-1 质粒连接构建针对 Bcl-2 的 siRNA 重组质粒 pshRNA-Bcl-2 及阴性对照的重组质粒 pshRNA-Yx。 方法:设计并查证针对目的基因 Bcl-2 及阴性对照的 siRNA 序列重庆医科大学硕士研究生学位论文 5后,设计合成相应的小发夹 RNA（short hairpin RNA, shRNA）。与具有荧光蛋白表达的 pGenesil-1 质粒连接构建针对 Bcl-2 的 siRNA 重组质粒 pshRNA-Bcl-2 及阴性对照的重组质粒 pshRNA-Yx。根据 pGenesil-1质粒表达后发绿色荧光的特点,在转染细胞后应用荧光显微镜观察计数表达了绿色荧光的细胞和总细胞数,其的发生率就是转染率。结果:经序列分析、电泳确证构建的针对 Bcl-2 的 shRNA 重组质粒 pshRNA-Bcl-2 及阴性对照的重组质粒 pshRNA-Yx 成功。在转染细胞后应用荧光显微镜观察计数表达了绿色荧光的细胞和总细胞数,绿色荧光细胞的发生率即转染率达 86%以上。结论:构建的重组质粒 pshRNA-Bcl-2 及阴性对照的重组质粒pshRNA-Yx 能够有效地作用于人卵巢癌细胞。本实验是利用 DNA 载体在细胞内转录 mRNA 而发挥作用,克服了合成 RNA 成本高费用大、转染率低的缺点,更有利于 RNAi 技术的推广和应用。第二部分 RNA 干扰 Bcl-2 对人卵巢癌 SKOV3 细胞增殖活性的影响目的:使用构建的表达靶 Bcl-2 基因 shRNA 的重组质粒转染细胞,观察其在人卵巢癌细胞 SKOV3 中对内源性 Bcl-2 基因表达的抑制作用以及对人卵巢癌细胞株 SKOV3 生物学性质的影响。方法:利用 MTT、电镜、RT-PCR 等方法研究在人卵巢癌细胞株SKOV3 中转染了针对 Bcl-2 的 shRNA 后,Bcl-2 的 mRNA 转录水平和Bcl-2 蛋白表达的变化;观察 shRNA 作用后,对 SKOV3 细胞凋亡的影响。采用免疫组织化学法检测 RNA 干扰后细胞 Bcl-2B、cl-xlB、ax、Caspase-3 蛋白的表达;用 MTT 法检测 RNA 干扰对 SKOV3 细胞活力的影响 。RT-PCR 检测 Bcl-2 基因 mRNA 水平。电子显微镜观察 SKOV3

论文目录

• 符号说明
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分 质粒重组
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第二部分 RNAiBcl-2 对 SKOV3 增殖活性的影响
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 图片
• 全文总结
• 课题创新性
• 综述一：RNA 干扰在基因治疗中的应用
• 综述二：Bcl-2 基因对乳腺癌细胞多药耐药性的影响
• 致谢
• 读硕期间第一作者发表论文情况
• 读硕期间申报课题
• 读硕期间参加大型学术活动情况