药物筛选研究——筛选甲状旁腺激素受体、降钙素受体激动剂和抗病毒天然化合物

论文题目: 药物筛选研究——筛选甲状旁腺激素受体、降钙素受体激动剂和抗病毒天然化合物

论文类型: 博士论文

论文专业: 中药学

作者: 栗世铀

导师: 肖培根,乔延江,谈学海

关键词: 骨质疏松,激动剂,甲状旁腺激素受体,降钙素受体,石蒜碱,严重急性呼吸综合症病毒,药物筛选,中草药

文献来源: 北京中医药大学

发表年度: 2005

论文摘要: 中草药中含有大量的、结构丰富的化合物,这些化合物是中药有效的物质基础。虽然部分化合物生物活性已经被发现,但更多成分的生物活性还未被阐明。本研究旨在进一步研究中草药类激素作用物质基础和抗病毒物质基础。首先,我们利用荧光检测技术、分子生物学、细胞生物学技术建立了基于细胞功能的高通量筛选方法,筛选并鉴定了淫羊藿 Epimedium brevicornum 中的类激素作用活性成分。其次,利用 MTS 检测病毒诱导细胞病变(CPE/MTS 法),对 3,700 种单体化合物和 200 余种中药提取物的抗病毒作用进行体外筛选,获得数种具有较强抗病毒作用的中药,进一步活性追踪获得了部分单体化合物。为中药类激素作用和抗病毒作用提供物质基础实验证明,为防治相关疾病提供新的手段。 第一部分:筛选并鉴定小分子非肽类甲状旁腺激素受体、降钙素受体激动剂 甲状旁腺激素(Parathyroid Hormone, PTH)和降钙素(Calcitonin, CT),是骨重建(Bone remodeling)的重要调控因子,具有促进骨形成、抑制骨吸收的作用,被用于治疗骨质疏松等骨代谢性疾病。目前 PTH 和 CT 制剂由于口服后在肠道中快速被降解致使只能采取非肠道的注射或鼻息给药,同时给与激素类药物导致细胞表面受体大量下调产生的强烈药物抵抗作用,也严重的影响了该药的使用。因此我们的实验目标是建立灵敏的 PTH 受体(Parathyroid hormone recaptor, PTHR)和 CT 受体(Calcitonin recaptor, CTR)激动剂的筛选方法,进行中草药化合物库筛选,以期发现 PTH 或 CT 类似物,特别是小分子、非肽类、可口服吸收的化合物,用于骨质疏松治疗。 本部分完成的主要工作及结果如下: 一、针对 PTHR 和 CTR,分别建立细胞荧光测试方法(方法学) 利用分子克隆技术,构建了 CTR 表达载体(pcDNA3.1-CTR/hygro)并测序验证。瞬时转染 pcDNA3.1-CTR/hygro 表达载体和 cAMP 反应元件(CRE)调控的增强型绿色荧光蛋白基因载体(pCRE-dEGFP/neo),观察荧光诱导情况,鉴定了以上各载体构建成功。同样方法鉴定了 PTHR 表达载体(pcPTHR/neo)。利用脂质体将受体和报告基因稳定转染哺乳动物细胞 HEK293 和 CHO-K1,抗性筛选结合有限稀 释 获 得 293-PTHR/CRE-dEGFP 、 CHO-PTHR/CRE-dEGFP 、293-CTR/CRE-dEGFP、CHO-CTR/CRE-dEGFP、293-CRE-dEGFP 筛选用克隆细胞系,并分别观察刺激剂诱导荧光强度变化。RT-PCR 鉴定受体表达程度。 中文摘要 III96 孔 板 中 利 用 脂 质 体 将 pcDNA3.1-CTR/hygro 表 达 载 体 瞬 时 转 染293-CRE-dEGFP 细胞系,观察 hCT 对绿色荧光蛋白(Green fluorescence protein,GFP)诱导情况。结果表明瞬时表达载体的筛选方法可用于 CTR 的筛选。结合荧光强度分析,我们进一步优化了过表达受体的 293-PTHR/CRE-dEGFP和 293-CTR/CRE-dEGFP 细胞系筛选条件。结果表明,分别在 PTH 和 CT 诱导下两株筛选用细胞系绿色荧光强度呈剂量依赖关系,EC50 分别为 2.3×10-8 M 和7.6×10-6 M,与 cAMP 测试结果接近;时效关系揭示,激动剂刺激后第 8 小时荧光强度达到最高,平台期持续大约 10 个小时,之后荧光强度开始缓慢下降;细胞密度优化实验表明,该测试方法可用于 96 孔板筛选,96 孔板中每孔加入 1×105细胞为最佳筛选密度;DMSO 在筛选体系中低于 1%的终浓度、血清低于 0.1%,对高通量筛选(high throughput screening, HTS)结果不会产生显著影响。二、高通量筛选中草药化合物库利用 PTHR 和 CTR 荧光测定方法,对 900 余种中药的 14,400 多个中药提取馏份及单体化合物进行筛选。初筛后,PTHR 细胞测试方法的 hit rate 为 0.12%,confirm rate 为 17.6%。CTR 细胞测试方法的 hit rate 为 0.09%c,onfirm rate 为 24.9%。重复实验及 293-CRE-d2EGFP 细胞排出非特异性激活的 hits 后,发现淫羊藿Epimedium brevicornum 中 分 离 的 单 体 黄 酮 类 成 分 Eb5 具 有 激 活PTHR/cAMP/PKA/CRE 信号转导通路的作用,EC50 为 0.13 μg/ml。细胞毒性实验显示细胞毒剂量大于 100 μg/ml。三、Eb5 对小鼠成骨细胞 MC3T3-E1 细胞增殖、基因表达和矿化功能的影响利用 MTS 检测 Eb5 对细胞增殖的影响,结果表明 Eb5 可显著刺激体外培养的成骨样细胞增殖。RT-PCR 半定量分析 Eb5 对 I 型胶原(type I collagen, COL I),碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALPase)和骨钙素(osteocalcin, OCN)基因表达的影响。结果表明 Eb5 作用 24 小时可显著上调以上各基因的表达。显微镜观察及茜素红法定量分析 Eb5 对 MC3T3-E1 细胞矿化结节形成的影响,结果表明 Eb5可显著促进 MC3T3-E1 细胞矿化功能。第二部分:筛选并鉴定抗流感病毒、抗 SARS 病毒化合物二十一世纪之初,SARS、致病性禽流感,这些烈性、病毒性传染病在世界IV 药物筛选研究范围内的迅速传播,严重的威胁着人类的健康,同时造成了巨大的社会经济损失。这些病毒传染病不能得到有效控制的主要原因是缺乏疫苗和有效的治疗药物。因此论文研究的另一个目标为筛选抗病毒药物,以期发现新的抗病毒先导化合物 。本部分完成的主要工作及结果如下:一、 筛选 3,700 种单体化合物和 200 余种中药提取物的抗 SARS 病毒作

论文目录:

目录

摘要

ABSTRACT

缩略语表

第一部分 筛选并鉴定小分子非肽类甲状旁腺激素受体、降钙素受体激动剂

第一章 前言

第二章 材料和方法

一、主要试剂及实验材料

二、实验方法

第三章 结果

一、基于受体-cAMP 信号转导通路功能测试方法的建立

二、高通量筛选中药化合物库

三、Eb5 对成骨细胞MC3T3-E1 增殖、分化和矿化功能的影响

第四章 讨论

一、甲状旁腺激素受体（PTHR）和降钙素受体（CTR）是治疗骨质疏松的重要药靶

二、PTHR 和CTR 信号转导通路与细胞报告基因药物筛选方法

三、筛选用细胞系的构建

四、高通量筛选中药化合物库

五、发现Eb5 是PTHR 的小分子非肽类激动剂

第二部分 筛选鉴定抗SARS 病毒、抗流感病毒天然化合物

第五章 前言

一、主要试剂及实验材料

二、实验方法

第七章 结果

第八章 讨论

一、体外抗病毒药物筛选方法的优化

二、中草药中鉴定抗SARS-CoV 和流感H1N1 病毒化合物

结论

综述

致谢

个人简历

发布时间: 2005-07-11

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