shRNA沉默Annexin A2基因对人肺腺癌细胞A549生物学行为的影响

论文摘要

背景与目的：肺癌是世界上发病率较高、治疗效果相对较差的恶性肿瘤,并已成为绝大多数国家癌症死亡的首要原因。恶性增殖和侵袭转移是肺癌恶性表型的最本质表现,是影响生存率和病死率的主要因素。膜联蛋白A2 （Annexin A2）是一类钙依赖性磷脂结合蛋白,具有多种重要的生物学功能,与多种疾病的发生有关。已有研究显示Annexin A2参与肿瘤细胞的DNA合成和侵袭转移,与大多数肿瘤的发生发展有关。我们在人支气管上皮癌变各阶段组织、肺鳞癌及癌旁组织的比较蛋白质组学、肺癌血清蛋白质组学的前期研究中发现Annexin A2在癌组织中高表达,且具有抗原性,但其机制不明。为进一步探讨Annexin A2与肺癌之间的关系,本课题应用RNA干扰（RNA interference, RNAi）技术研究Annexin A2基因沉默对人肺腺癌细胞A549生物学行为的影响,为进一步阐明Annexin A2在肺癌恶性进展中的分子机制、寻找预防及治疗肺癌侵袭转移的潜在靶标提供实验依据。方法：（1）以人肺腺癌A549细胞株为研究对象,体外构建Annexin A2序列特异性双链短发卡RNA （short hairpin RNA, shRNA）质粒,脂质体介导转染A549细胞,同时设无关序列组、空载体组、空白组为对照组,于转染后24小时荧光显微镜观察转染效率和转染后48小时收集shRNA质粒干扰细胞。（2）采用半定量RT-PCR方法检测各组细胞Annexin A2 mRNA的表达。（3）用Western blot和免疫细胞化学方法检测各组细胞Annexin A2蛋白质表达。（4）通过MTT法测定各组细胞增殖能力。（5）用Transwell小室模型检测各组细胞体外侵袭能力。（6）利用ELISA方法检测各组培养细胞上清中基质金属蛋白酶-2（matrix metalloproteinase-2, MMP-2）和组织蛋白酶B（cathepsin B, CB）的浓度。结果：（1）AnnexinA2 shRNA质粒成功转染人肺腺癌A549细胞,转染效率达60%。（2）转染48小时后,shRNA转染组Annexin A2的mRNA及蛋白质表达水平均明显下调（p<0.05）、（p<0.05）,细胞增殖活性显著降低（p<0.05）,细胞的体外侵袭能力明显减弱（p<0.05）,其培养上清中MMP-2和CB的浓度显著减少（p<0.05）、（p<0.05）。结论：（1）采用RNA干扰技术能有效降解Annexin A2 mRNA,抑制其蛋白的表达,显著降低人肺癌细胞增殖、体外侵袭能力。（2）Annexin A2基因表达的下调能引起下游靶基因MMP-2及CB的表达下降。（3）表明Annexin A2在肺癌的发生发展及侵袭转移中起着重要的作用,调控MMP-2及CB的表达可能是Annexin A2影响人肺腺癌A549细胞的生物学行为的途径之一。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 缩略词表及注释
• 前言
• 实验技术路线
• 第一章 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验方法
• 第二章 结果
• 2.1 荧光检测Annexin A2 shRNA质粒转染A549细胞效率评价
• 2.2 半定量RT-PCR检测Annexin A2 mRNA表达差异
• 2.3 Western blot检测Annexin A2蛋白表达差异
• 2.4 免疫细胞化学检测Annexin A2蛋白表达差异
• 2.5 MTT检测A549细胞增殖能力变化
• 2.6 Transwell小室模型检测A549细胞体外侵袭能力变化
• 2.7 ELISA检测A549细胞上清中MMP-2及CB浓度差异
• 第三章 讨论
• 第四章 结论
• 参考文献
• 综述
• 致谢
• 攻读学位期间的主要成果