Cr（Ⅵ）诱导肝细胞凋亡与线粒体电子传递链功能障碍的关系

论文摘要

目的：在体外试验系统,初步探讨线粒体电子传递功能障碍在Cr（Ⅵ）诱导细胞凋亡中的作用,进一步阐明Cr（Ⅵ）诱导细胞凋亡的可能机制。方法：以L-02肝细胞为受试细胞,通过MTT试验检测Cr（Ⅵ）及与呼吸抑制剂（DPI、ROT、AA）或保护剂（Vit C）联合作用对L-02肝细胞存活率的影响,筛选出25μmol/L Cr（Ⅵ）、2.5μmol/L DPI、5μmol/L ROT、lμg/mL AA和2mmol/L Vit C进行后续试验,染毒时间为12h。通过紫外可见分光光度计检测线粒体内Cr（Ⅵ）的还原速率,多功能酶标仪检测细胞内ATP含量和活性氧（ROS）的含量变化,氧电极检测细胞线粒体呼吸功能（耗氧速率）,酶标仪检测细胞内caspase-3的活性,流式细胞仪检测细胞凋亡率检测细胞凋亡结果：1.Cr（Ⅵ）引起L-02肝细胞存活率降低：Cr（Ⅵ）在10-100μmol/L处理浓度范围内,能明显引起L-02肝细胞存活率的降低（P<0.05）,处理浓度和细胞存活率之间存在负相关（r12h=—0.980,P<0.05）,选取对Cr（Ⅵ）处理的细胞生存率影响较明显2.5μmol/L DPI、5μmol/L ROT1μg/mL AA和2mmol/L Vit C进行后续试验。2.线粒体内Cr（Ⅵ）还原速率：不同呼吸底物对线粒体中Cr（Ⅵ）的还原速率的影响不同,复合体Ⅰ的底物苹果酸+谷氨酸使线粒体中Cr（Ⅵ）的还原量显著增加,而复合体Ⅳ的底物Vit C使线粒体中Cr（Ⅵ）的还原量明显降低（P<0.05）。不同呼吸抑制剂对线粒体中Cr（Ⅵ）的还原速率的影响不同（P<0.01）。复合体Ⅳ抑制剂NaN3时,线粒体中Cr（Ⅵ）的还原量最大（P<0.05）。3.Cr（Ⅵ）对肝细胞细胞呼吸功能影响：与对照组相比, Cr（Ⅵ）单独处理组细胞氧耗速率明显降低（P<0.05）；与相同浓度的Cr（Ⅵ）单独处理组相比,加入呼吸链抑制剂（DPI、ROT、AA）联合处理组细胞耗氧速率均明显降低（P<0.05）,加入VitC联合处理组细胞耗氧速率明显增高（P<0.05）4.Cr（Ⅵ）对肝细胞ATP含量的影响：与对照组相比, Cr（Ⅵ）单独处理组ATP含量明显降低（P<0.05）；与相同浓度的Cr（Ⅵ）单独处理组相比,加入呼吸链抑制剂（DPI、ROT、AA）联合处理组ATP含量均明显降低（P<0.05）,加入VitC联合处理组ATP含量明显增高（P<0.05）5.Cr（Ⅵ）对肝细胞氧化应激的影响：与对照组相比,Cr（Ⅵ）单独处理组细胞ROS产量明显增高（P<0.05）；与相同浓度的Cr（Ⅵ）单独处理组相比,加入呼吸链抑制剂（DPI、ROT、AA）联合处理组细胞ROS产量均明显增高（P<0.05）,加入Vit C联合处理组ROS产量明显降低（P<0.05）。6.Cr（Ⅵ）对肝细胞caspase-3的影响：与对照组相比,Cr（Ⅵ）单独处理组caspase-3活性明显升高（P<0.05）；与相同浓度的Cr（Ⅵ）单独处理组相比,加入呼吸链抑制剂（DPI、ROT、AA）联合处理组细胞caspase-3活性该变量均明显升高（P<0.05）,加入Vit C联合处理组细胞caspase-3活性明显降低（P<0.05）。7.Cr（Ⅵ）诱导肝细胞凋亡：与对照组相比,Cr（Ⅵ）单独处理组细胞凋亡率明显升高（P<0.05）；与相同浓度的Cr（Ⅵ）单独处理组相比,加入呼吸链抑制剂（DPI、ROT、AA）联合处理组细胞凋亡率均明显升高（P<0.05）,加入Vit C联合处理组细胞凋亡率明显降低（P<0.05）。结论：1.Cr（Ⅵ）从线粒体复合体Ⅰ得到电子而被还原,在此还原过程中产生ROS,产生的ROS诱导线粒体损伤和细胞凋亡因子caspase-3释放,从而诱导L-02肝细胞凋亡。2.主呼吸链抑制剂（尤其是ROT）能使呼吸链电子从复合体Ⅰ漏出,使Cr（Ⅵ）还原增加,使Cr（Ⅵ）诱导细胞凋亡的作用增强。3. VitC能减轻Cr（Ⅵ）引起的线粒体损伤,使线粒体呼吸功能部分恢复,使细胞内ATP水平升高,影响caspase3的活性,拮抗Cr（Ⅵ）诱导的细胞凋亡。4.在Cr（Ⅵ）诱导的L-02肝细胞凋亡过程中,电子传递功能障碍起重要作用。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 前言
• 第二章 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 受试细胞
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 主要试剂溶液的配制
• 2.1.4 主要仪器
• 2.2 方法
• 2.2.1 试验技术路线
• 2.2.2 肝细胞培养
• 2.2.3 肝细胞的培养与生存率测定
• 2.2.4 肝细胞线粒体中Cr（Ⅵ）的还原速率测定
• 2.2.5 肝细胞呼吸功能检测
• 2.2.6 肝细胞ATP含量测定
• 2.2.7 肝细胞氧化应激检测
• 2.2.8 肝细胞凋亡检测
• 2.2.9 统计分析
• 第三章 结果
• 3.1 Cr（Ⅵ）对肝细胞存活率的影响
• 3.2 肝细胞线粒体中Cr（Ⅵ）的还原速率
• 3.4 Cr（Ⅵ）对肝细胞呼吸功能的影响
• 3.5 Cr（Ⅵ）对肝细胞能量代谢的影响
• 3.6 Cr（Ⅵ）对肝细胞氧化应激的影响
• 3.7 Cr（Ⅵ）对肝细胞caspase-3活性的影响
• 3.8 Cr（Ⅵ）对肝细胞凋亡率的影响
• 3.9 肝细胞电子传递障碍与细胞凋亡及其相关指标的相关性
• 第四章 讨论
• 4.1 不同氧化还原状态下,肝细胞线粒体中Cr（Ⅵ）的还原速率
• 4.2 Cr（Ⅵ）染毒对肝细胞能量代谢和呼吸功能的影响
• 4.3 Cr（Ⅵ）诱导电子传递链障碍与细胞内氧化应激关系
• 4.4 Cr（Ⅵ）诱导细胞凋亡与线粒体电子传递链功能障碍的关系
• 4.5 Vit C对Cr（Ⅵ）诱导的细胞凋亡与电子传递链功能障碍的保护作用
• 第五章 结论
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 致谢
• 研究生期间主要的研究成果