白三烯自分泌/旁分泌环路在大鼠急性肝损伤模型中表达特征及积雪草酸的调控

论文摘要

1白三烯合成酶系在大鼠急性肝损伤模型中表达特征目的:探索白三烯合成相关酶系在D-GalN/LPS或CCl4诱导的大鼠肝损伤模型中表达和活性变化,为揭示急性肝损伤发生发展病理基础提供相关依据。方法:大鼠经腹腔注射D-GalN/LPS 1,3,6,12 h诱导肝脏急性损伤模型,并与经D-GalN/LPS所致体外损伤原代培养肝细胞模型比较;或注射CCl4 3,6,12,24 h诱导肝脏损伤模型。用酶联免疫分析法测定cys-LT量;用HPLC检测LTC4合成酶系酶活力;RT-PCR测定LTC4S和mGST2 mRNA表达;Western blot检测LTC4S蛋白表达;免疫组化定位测定LTC4S和mGST2蛋白表达。体外建立肝实质细胞和肝细胞共培养体系,D-GalN/LPS损伤以模拟整体大鼠急性肝损伤模型。结果:D-GalN/LPS处理6,12 h出现显著的大鼠肝脏损伤,但在处理1,3 h时,即伴有cys-LT含量急剧增加,提示cys-LT聚集极有可能与肝损伤相关。D-GalN/LPS处理1 h起,白三烯合成酶系表达呈上调趋势,伴有酶活力显著增强。D-GalN/LPS处理原代培养肝细胞中cys-LT含量极低且无显著变化;LTC4S和mGST2基因表达和酶活力也无显著变化。原代大鼠肝细胞和枯否细胞共培养体系D-GalN/LPS损伤,结果与整体实验相吻,提示可较好地模拟整体肝脏损伤模型。结论:大鼠D-GalN/LPS急性肝损伤模型中,炎症因子cys-LT聚集与肝损伤相关;Cys-LT聚集与白三烯合成酶系的表达上调和酶活力增强相关;大鼠D-GalN/LPS急性肝损伤中cys-LT及其合成酶系表达增加需要肝非实质细胞参与;肝细胞和枯否细胞共培养体系D-GalN/LPS损伤模型,可替代整体模型用于研究LTC4合成酶系在肝脏中作用。2白三烯受体在大鼠肝组织中定位及在D-GalN/LPS急性肝损伤中表达变化目的:探索大鼠肝组织中cysLT1R表达及定位,在D-GalN/LPS急性肝损伤过程中cysLT1R表达变化。方法:采用RT-PCR、Western blot和免疫组化法检测cysLT1R在大鼠肝脏及肝细胞中表达;采用工具药观察肝细胞中表达情况,即用LTD4刺激后,检测细胞内钙变化,并观察特异性受体拮抗剂ONO-1078处理对内钙变化的影响。构建大鼠D-GalN/LPS急性肝损伤模型,检测cysLT1R的表达变化。结果:RT-PCR和Western blot检测均表明大鼠肝脏及肝细胞中有mRNA和蛋白表达;免疫组化法检测表明cysLT1R分布于内皮细胞和肝细胞的细胞膜上。采用工具药观察结果也表明肝细胞中存在cysLT1R表达。大鼠D-GalN/LPS处理6、12 h后肝脏cysLT1R表达增加。结论:大鼠肝脏内皮细胞及肝细胞中表达cysLT1R,且在D-GalN/LPS处理后期存在表达增加。3积雪草酸对大鼠原代肝细胞共培养体系损伤保护作用及对白三烯环路相关的调控机制研究目的:探索Redox信号通路对大鼠原代肝细胞和枯否细胞共培养体系D-GalN/LPS损伤中LTC4S表达的调控,研究AA对其保护作用及其保护机制是否与影响该通路相关。方法:检测共培养体系中redox相关因子ROS和GSH量,及redox下游信号ERK和NF-κB信号分子的时效变化,并通过信号通路特异性抑制剂U0126或redox抑制剂PDTC研究,对共培养体系LTC4S的调控进行研究。以细胞活力、细胞增殖、细胞形态和AST、LDH为指标观察肝细胞和枯否细胞共培养体系D-GalN/LPS损伤的保护作用。JC-1染色法测定线粒体膜电位,AO-EB观察细胞损伤情况,DNA片断化检测细胞有无片段化,荧光探针法检测共培养体系中ROS和GSH含量。Western blot方法分析此模型中白三烯合成相关蛋白5-LO、FLAP、LTC4S和cysLT1R表达变化。1,3,10μmol/L AA预处理共培养体系后,再对以上指标进行检测。结果:共培养体系D-GalN/LPS损伤后,呈现ROS生成增加和ERK、NF-κB激活。特异性抑制剂预处理后,ERK和ROS激活受抑制并伴有一定程度逆转LTC4S表达上调;且对共培养体系D-GalN/LPS所致损伤有一定保护作用。细胞活力、细胞增殖、细胞形态和AST、LDH等指标均表明AA对肝细胞和枯否细胞共培养体系D-GalN/LPS损伤有保护作用。JC-1染色结果、AO-EB和DNA片断化检测结果表明D-GalN/LPS处理后出现凋亡,AA预处理能部分抑制细胞凋亡。共培养体系D-GalN/LPS损伤后ROS生成增加、GSH含量降低和GSH/GSSG比值降低,表明体系内氧化还原态损伤;AA预处理部分逆转氧化还原态失衡。AA预处理抑制共培养体系D-GalN/LPS损伤所致5-LO、FLAP、LTC4S和cysLT1R表达上调和cys-LT增加。结论:D-GalN/LPS损伤肝细胞和枯否细胞共培养体系中LTC4S表达受redox信号通路调控;AA对此损伤的共培养体系有保护作用,其机制可能与调控细胞内氧化还原态,进而干预白三烯自分泌/旁分泌环路相关。

论文目录

• 致谢
• 前言
• 中文摘要
• Abstract
• 目次
• 1 白三烯合成酶系在大鼠急性肝损伤模型中表达特征
• 1.1 引言
• 1.2 材料与仪器
• 1.3 方法
• 1.4 结果
• 1.5 讨论
• 2 大鼠肝脏白三烯受体表达及其在急性肝损伤变化
• 2.1 引言
• 2.2 材料与仪器
• 2.3 方法
• 2.4 结果
• 2.5 讨论
• 3 积雪草酸对大鼠原代肝细胞和枯否细胞共培养体系损伤保护作用及与白三烯环路相关的机制研究
• 3.1 引言
• 3.2 材料与仪器
• 3.3 方法
• 3.4 结果
• 3.5 讨论
• 附:D-GalN和CCl4大鼠原代培养肝细胞损伤模型用于积雪草护肝活性部位筛选
• 4.1 引言
• 4.2 材料与仪器
• 4.3 方法
• 4.4 结果
• 4.5 讨论
• 参考文献
• 综述
• 作者简介