论文摘要
背景与目的结肠癌是常见的恶性肿瘤。结肠癌手术前或术后转移发生率高,这样,多数患者失去手术治愈的机会。化学治疗是进展期结肠癌的主要治疗手段,但耐药性的产生常导致结肠癌化疗失败。尽管新的化疗药物和联合方案不断推出,但疗效并没有明显提高。因此,仍迫切需要探寻治疗结肠癌和提高化疗效果的新策略。活跃的糖酵解代谢是恶性肿瘤细胞显著的生化特征,是肿瘤细胞能量ATP的重要来源。即使在有氧条件下,糖酵解代谢仍明显活跃。肿瘤细胞这一特殊生化表型,被称为Warburg效应。临床上已利用肿瘤细胞特异性的Warburg效应,通过正电子发射断层显像（positron emission tomography,PET）技术来诊断恶性肿瘤,而探索通过干预糖酵解代谢途径来治疗恶性肿瘤的策略正备受关注。己糖激酶（hexokinase,HK）是调节细胞糖酵解的关键限速酶。在大多数分化差的恶性肿瘤细胞中,以HK-II亚型高表达为主。正常情况下,HK-II仅在心脏、骨骼肌和脂肪组织中微量表达。近些年研究的重要发现,HK-II除了具有糖代谢酶的催化活性,还有拮抗细胞凋亡的功能。药物抑制HK-II可诱导恶性肿瘤细胞及其耐药株凋亡,而其作用机制还需进一步阐明。体外细胞培养和动物体内实验显示,结肠癌细胞HK活性增高;临床病理标本检测也发现,结肠癌组织糖酵解酶表达增高。但关于HK-II在人结肠癌细胞中的表达、治疗意义以及其相关作用机制还尚不明确。结肠癌对化疗不太敏感。影响结肠癌化疗耐药的因素较多,其中能量代谢（ATP合成增多）,以及抗凋亡作用增强均与化疗耐药相关。HK-II蛋白兼有促进能量ATP合成和拮抗凋亡的双重功能,推测HK-II与结肠癌化疗敏感性有关。这也有待于证实,并探讨其它的可能作用机制。与细胞生存密切相关的PI3激酶信号通路异常活化也是恶性肿瘤的常见现象,它参与调控细胞糖酵解代谢。研究已表明,HK-II的生物学功能受丝/苏氨酸激酶（Akt）分子调控。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin,mTOR）是PI3激酶信号通路中位于Akt下游的重要信号转导分子,在许多恶性肿瘤细胞明显活化。mTOR信号通路是否可通过调控HK-II表达来影响结肠癌细胞增殖及化疗敏感性还不清楚。本课题拟通过抑制HK-II,观察结肠癌细胞增殖、化疗敏感性和凋亡相关因子的变化,以探讨HK-II在结肠癌细胞增殖和化疗中的作用及机制;通过抑制mTOR,观察结肠癌细胞增殖、化疗敏感性以及HK-II表达的变化,以探讨mTOR信号通路对结肠癌细胞HK-II表达的调控机制。方法1.采用RT-PCR和Western印迹法,检测4种人结肠癌细胞株HK-II基因和mTOR基因mRNA和蛋白表达。2.应用MTT、DNA琼脂糖凝胶电泳、Hoechst33258核染色及比色法,观察HK-II阻断药物（3-bromopyruvic acid,5-BrPA）对结肠癌细胞增殖、凋亡和化疗的影响。通过流式细胞仪检测线粒体膜电位（mitochondria membrane voltage,ΔΨm）、紫外分光光度计测定线粒体膜通透转换孔（permeability transition pores,PTP）开放及Western印迹法检测线粒体结合型HK-II表达,探讨5-BrPA拮抗HK-II与线粒体结合导致的细胞凋亡机制。3.构建靶向HK-II基因的短发夹RNA（short hairpin RNA,shRNA）真核表达质粒（pGenesil-1-HK-II）,稳定转染结肠癌LoVo细胞。实验分三组:1组为正常培养组LoVo细胞,2组为转染质粒pGenesil-1-HK-II的LoVo细胞阳性实验组,3组为转染质粒pGenesil-1的LoVo细胞阴性对照组。采用MTT法、流式细胞仪、Western印迹法及高效液相色谱仪（high performance liquid chromatography,HPLC）,检测结肠癌LoVo细胞增殖、克隆形成能力、细胞周期、细胞内ATP含量、胸苷酸合成酶（thymidylate synthase,TS）以及化疗敏感性的变化。将上述三组LoVo细胞接种于裸鼠背部皮下,4周后测量皮下瘤体积和称重,免疫组织化学染色法检测肿瘤组织Ki-67表达,TUNEL法分析细胞凋亡。4.在体外细胞培养实验中,通过mTOR阻断剂（雷帕霉素,rapamycin）和RNA干扰（RNA interference,RNAi）技术抑制mTOR,应用MTT法检测结肠癌细胞增殖、化疗敏感性变化,以及rapamycin与3-BrPA的联合抗癌效应;并用Western印迹法分析结肠癌LoVo细胞HK-II表达变化。在体内实验中,将LoVo细胞接种于裸鼠背部皮下,4周后测量皮下瘤体积并称重,免疫组织化学染色法检测肿瘤组织mTOR、HK-II和Ki-67表达,TUNEL法检测细胞凋亡。结果1.HK-II和mTOR基因mRNA和蛋白在结肠癌HCT-116、LoVo、HT-29和SW480细胞中均明显表达。2.不同浓度（50、100、150、300μmol/L）3-BrPA分别作用LoVo、HCT-116、HT-29、SW480细胞48h,结肠癌细胞增殖均受到明显抑制。小剂量3-BrPA（25μmol/L）分别与低剂量化疗药物（5-FU和L-OHP）联合作用LoVo细胞48h。检测显示,小剂量3-BrPA单独作用LoVo细胞的48h细胞增殖抑制率为（8.4±2.1）%;5-FU（1.25、2.5μg/ml）与之联合应用48h,细胞增殖抑制率则由（19.2±2.3）%和（40.6±1.9）%分别提高到（40.0±2.9）%和（56.6±2.8）%（均P<0.01）;而L-OHP（0.5、1.0μg/ml）与之联合应用48h,细胞增殖抑制率则由（19.2±6.1）%和（32.2±2.2）%分别提高到（48.4±3.2）%和（60.5±4.6）%（均P<0.01）。3.DNA片段琼脂糖凝胶电泳法、Hoechst33258核染色法和比色法检测显示,3-BrPA可诱导结肠癌LoVo细胞凋亡。3-BrPA可拮抗结肠癌LoVo细胞HK-II与线粒体的结合。3-BrPA和CaCl2诱导的线粒体PTP开放程度分别为（40.0±3.5）%和（37.4±2.3）%（P=0.348）,提示3-BrPA抑制HK-II可诱导结肠癌LoVo细胞线粒体PTP开放。100μmol/L 3-BrPA作用结肠癌LoVo细胞1、3、5h,细胞线粒体膜电位下降率分别为12.69%、15.38%和26.82%。4.RNAi技术可特异性沉默LoVo细胞HK-II基因表达,mRNA和蛋白水平表达抑制率分别为72.1%和71.2%。沉默HK-II基因表达可使LoVo细胞体外生长和克隆形成能力明显下降。与正常培养的LoVo细胞相比,HK-II-RNAi的LoVo细胞其G0/G1期细胞数增加12.4%,S期的细胞数减少8.4%,细胞凋亡率增加9.1%（均P<0.01）。HK-II-RNAi的LoVo细胞ATP含量明显低于正常培养的LoVo细胞（1.5±0.2nmol/106 cell比2.5±0.2 nmol/106cell,P<0.01）。与正常培养的LoVo细胞比较,HK-II-RNAi的LoVo细胞5-FU和L-OHP的IC50值均明显降低（4.70±0.40μg/ml比11.93±0.15μg/ml,6.27±0.59μg/ml比9.77±0.60μg/ml）,TS蛋白表达水平下降,caspase-3活性则显著增高。5.裸鼠体内实验中,HK-II-RNAi的LoVo细胞皮下瘤平均体积和平均重量均明显小于正常培养的LoVo细胞（P<0.01）。与正常培养的LoVo细胞组比,HK-II-RNAi的LoVo细胞皮下瘤增殖指数显著下降（33.00±3.16比44.03±3.08,P<0.01）,而凋亡指数则明显升高（7.47±1.29比3.21±0.68,P<0.01）。6.不同浓度rapamycin刺激结肠癌细胞72h,细胞增殖受到明显抑制。Rapamycin（100nmol/L）单药作用LoVo细胞60h的细胞增殖抑制率为（22.6±3.7）%;低剂量3-BrPA（25、50μmol/L）与之联合用药（rapamycin预处理12h）48h,细胞增殖抑制率由（6.9±1.7）%和（13.2±3.2）%分别提高到（38.7±4.7）%和（57.5±6.6）%（均P<0.01）。7.Rapamycin（100nmol/L）能明显抑制LoVo细胞HK-II蛋白表达,并可阻断表皮生长因子（EGF,10ng/ml）诱导的HK-II蛋白表达增强效应。RNAi沉默mTOR基因表达可下调LoVo细胞HK-II基因表达,mRNA和蛋白水平表达抑制率分别为66.1%和69.5%。mTOR-RNAi的LoVo细胞裸鼠皮下瘤组织mTOR和HK-II表达也明显降低。8.与正常培养的LoVo细胞比较,mTOR-RNAi的LoVo细胞5-FU和L-OHP的IC50值均明显降低（6.53±0.60μg/ml比11.93±0.15μg/ml , 7.03±0.65μg/ml比9.77±0.60μg/ml,均P<0.01）。RNAi下调mTOR表达可明显抑制结肠癌LoVo细胞体内外增殖。与正常培养的LoVo细胞相比,mTOR-RNAi的LoVo细胞皮下瘤增殖指数显著下降（27.65±3.03比44.03±3.08,P<0.01）,而凋亡指数则明显升高（8.77±1.46比3.21±0.68,P<0.01）。结论1.HK-II阻断剂3-BrPA可通过拮抗HK-II与线粒体结合、降低线粒体膜电位、增加线粒体膜通透性等机制来诱导结肠癌细胞凋亡。2.RNAi技术可特异性阻断结肠癌LoVo细胞HK-II基因表达,通过减少细胞内ATP合成和增加细胞凋亡途径来抑制LoVo细胞体内外增殖。3.抑制HK-II可通过诱导线粒体膜通透转换孔开放、降低线粒体膜电位、活化caspase-3、增加细胞凋亡以及减少胸苷酸合成酶表达等机制来增强结肠癌LoVo细胞对化疗药物的敏感性。4.mTOR信号通路可通过调控HK-II表达来影响结肠癌LoVo细胞增殖和化疗敏感性。5.联合抑制mTOR和HK-II对LoVo细胞有协同杀伤作用,提示可通过多靶点干预细胞糖酵解途径治疗结肠癌。
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