木素过氧化物酶对疏水性芳香化合物的高效降解及机制研究

论文摘要

木素是自然界中仅次于纤维素的第二大有机碳源。木素的降解已构成自然界碳素循环的限速步骤。白腐菌是自然界中唯一能够彻底降解木素的微生物,黄孢原毛平革菌是其典型菌种。白腐菌降解木素主要依靠细胞分泌的木素降解酶系,其中木素过氧化物酶（LiP）是最重要的一种。藜芦醇（VA）是白腐菌的次级代谢产物,也是LiP的生理底物。有关藜芦醇在木素降解中的作用多年来一直是学术界争论的焦点。白腐菌降解木素主要是过氧化物酶参与的自由基氧化过程,这种独特的自由基氧化机制引起了环境科学工作者的关注。1985年,Bumpus等首次报道纯培养的黄孢原毛平革菌能降解多环芳烃化合物,此后,利用白腐菌降解环境污染物的研究成了环境科学领域里的研究热点。本论文以黄孢原毛平革菌分泌的具有高氧化性能的LiP酶为氧化剂,酚型或非酚型芳香化合物为模型化合物,通过H2O2酶法缓释、反胶束中LiP活力的介质调控以及添加电子介体等手段和方法提高了LiP对疏水性芳香化合物的降解效率,阐明了不同介质中VA介导LiP催化氧化芳香化合物的介导机制。上述一系列较为系统深入的工作对于提高疏水性污染物的LiP酶解效率、进一步弄清VA在白腐菌降解木素过程中的作用与机制等具有十分重要的意义。本论文的具体研究内容与结果如下:一.通过双酶耦联及介质调控实现疏水性芳香化合物的高效降解1.葡萄糖氧化酶与LiP耦联,使H2O2缓释,实现芳香染料的高效降解H2O2的提供方式是影响LiP对污染物降解效率的关键因素之一。在本文中,我们用葡萄糖氧化酶催化氧化葡萄糖来产生和控制H2O2,并将之与LiP催化氧化芳香化合物的反应相耦合。通过调节反应体系的pH及葡萄糖氧化酶的加入量可以方便的控制体系H2O2的生成速率。由于H2O2缓释,避免了一次性加入H2O2时H2O2对LiP的失活现象,从而使LiP在较长时间内保持较高的催化活力。芳香染料降解实验表明酶法H2O2缓释的方法可以明显提高LiP对芳香染料的降解效率。2.介质调控LiP高效降解疏水性芳香化合物研究疏水性芳香化合物在水中溶解度很小,而LiP是水溶性酶,因此水介质中LiP降解疏水性芳香化合物的效率低。反胶束可以提高疏水性芳香化合物的溶解度,而且LiP在反胶束中也可以保持一定的催化活力,因此用反胶束介质代替水介质应该可以提高LiP对疏水性芳香化合物的降解效率。反胶束介质中疏水性芳香化合物的降解效率取决于LiP在反胶束中的活力及H2O2的含量。在先前工作基础上,通过一定量的AOT与Brij30复配,形成了一种新的AOT/Brij30反胶束体系。该体系克服了传统的单一表面活性剂体系低LiP活力的缺点,通过反胶束介质电性质及反胶束大小等条件优化,获得了AOT/Brij30反胶束中高的LiP活力。高浓度的H2O2对LiP的催化活力起抑制作用,而且反胶束介质中这种抑制作用更加突出。鉴于这种情况,我们将前文的酶法H2O2缓释方法移植到AOT/Brij30反胶束体系中,进一步改善了LiP在反胶束中的催化活力。三苯甲烷类染料降解实验表明在AOT/Brij30反胶束体系中,用GOD/LiP双酶耦联的方式可以显著提高染料的降解效率,为反胶束介质中疏水性芳香化合物的LiP酶转化奠定了基础。二.不同介质中,VA介导LiP催化氧化芳香化合物反应的双底物机制1.水介质中H2O2调控VA介导LiP催化氧化邻苯三酚红（PR）反应研究LiP催化H2O2氧化邻苯三酚红（PR）反应的氧化产物受H2O2与PR的摩尔比控制,H2O2与PR的摩尔比不同,所得降解产物不一样。分析表明,H2O2在LiP催化氧化PR过程中的双重作用（即低浓度的H2O2是LiP的激活剂,高浓度的H2O2是LiP的抑制剂）是导致上述现象的根本原因。藜芦醇（VA）对LiP催化氧化PR的反应有促进作用,尤其是当H2O2与PR的摩尔比较高时这种促进作用更为明显;然而PR对LiP催化氧化VA的反应却有抑制作用。后者可以用来解释为什么在用白腐菌降解染料时在培养液中常常检测不到LiP的藜芦醇活力。分析表明,VA的存在不但促进了LiP酶中间体LiP（Ⅱ）和/或LiP（Ⅲ）向LiP的转化,使LiP的催化循环加速,VA生成的VA+·也间接氧化了染料PR,从而使PR的氧化速率提高。2.反胶束介质中VA介导LiP催化氧化PR反应的机制白腐菌降解木素及环境污染物是在与本体水差别盛大的胶体介质中进行的,反胶束更接近LiP的天然环境,因此反胶束介质中VA介导LiP催化氧化反应机制的研究将更有助于阐明VA在木素及环境污染物降解中的作用。AOT/Brij30反胶束中VA介导LiP催化氧化PR反应机制的研究表明:反胶束介质中VA对LiP催化氧化PR的反应有促进作用,即使是在低H2O2浓度下。此外,VA的促进作用随VA浓度的增大而增大,直至最大值。对一系列设计实验所得结果的综合分析表明,与水介质中不同,反胶束介质中VA对LiP催化氧化PR反应的促进作用主要是VA+·对PR的间接氧化作用,VA对LiP的保护作用并不显著。3.介质对VA+·寿命的影响VA+·自由基的寿命是阐明VA在木素降解初始过程中的作用的关键,也是阐明VA介导LiP催化氧化芳香化合物反应机制的关键。以往关于VA+·自由基寿命的研究都是在水介质中进行的,而LiP的天然环境与水介质差别盛大。不同介质中VA+·的寿命应该是不一样了。因此,在这一部分工作中,我们研究了介质对几种自由基寿命的影响。结果表明,与水介质中相比,反胶束介质中自由基的寿命均明显变长,且变化的程度与自由基的结构有关。以苯酚阳离子自由基为例,水介质与反胶束介质中,苯酚自由基的衰减动力学常数分别为kaqueousmedium=0.023s-1,kreversed micelles=5.8×10-3s-1。反胶束介质介电常数的减小有可能是导致阳离子自由基衰减变慢的主要原因。LiP活性中间体而非LiP可以稳定阳离子自由基,延长自由基寿命。三.色氨酸对LiP催化氧化芳香化合物的促进作用色氨酸（TRP）对LiP催化氧化芳香化合物的促进作用与芳香化合物的氧化还原电位有关。对于氧化还原电位高于TRP的物质,TRP对其酶促反应有抑制作用;而对氧化还原电位低于TRP的物质,TRP则可以促进其氧化。以PR为模型化合物,我们研究了TRP促进LiP催化氧化PR反应的反应机制。研究表明:TRP可以促进LiP催化氧化PR的反应。与VA一样,TRP对LiP催化氧化PR反应的促进也是通过两种方式进行的:1)TRP与LiP（Ⅱ）和/或LiP（Ⅲ）反应,帮助LiP完成其催化循环。与VA相比,TRP还原LiP（Ⅲ）似乎更有效。（2）TRP+·对PR有间接氧化作用。TRP+·是具有氧化还原活性的中间体,它可以间接氧化像PR这样的芳香类化合物。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 符号与缩写
• 第一章 绪论
• 1.1 白腐菌
• 1.1.1 白腐菌生物降解的特点
• 1.1.2 白腐菌的降解原理
• 1.1.3 白腐菌应用于污染物降解的研究
• 1.2 木素过氧化物酶
• 1.2.1 LiP的结构
• 1.2.2 LiP的催化循环
• 2O₂在LiP催化氧化反应中的作用'>1.2.3 H₂O₂在LiP催化氧化反应中的作用
• 1.2.4 藜芦醇（VA）
• 1.2.5 LiP用于污染物降解的研究
• 1.3 胶束酶学
• 1.3.1 反胶束
• 1.3.2 胶束酶学简介
• 1.4 LiP在反胶束中催化性能的研究
• 1.5 本论文的立题依据和研究内容
• 1.5.1 立题依据
• 1.5.2 研究内容
• 参考文献
• 第二章 木素过氧化物酶与葡萄糖氧化酶偶联实现芳香性染料的高效降解
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 仪器与试剂
• 2.1.2 LiP酶液的制备
• 2.1.3 LiP酶活力标定
• 2.1.4 GOD活力标定
• 2.1.5 双酶体系中LiP催化氧化VA反应初速率测定方法
• 2.2 结果与讨论
• 2O₂对LiP催化氧化VA的双重作用'>2.2.1 H₂O₂对LiP催化氧化VA的双重作用
• 2.2.2 GOD、glucose、葡萄糖内酯对LiP活力的影响
• 2.2.3 双酶体系的最适pH
• 2.2.4 A—t曲线的比较
• 2.2.5 染料降解
• 2.3 结论
• 参考文献
• 第三章 介质调控LiP高效降解疏水性芳香化合物
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 仪器与试剂
• 3.1.2 反胶束溶液的配制（一般方法）
• 3.1.3 LiP酶的制备及活力的标定
• 3.1.4 GOD活力标定
• 3.1.5 双酶体系中LiP催化氧化VA反应初速率测定方法
• 3.2 结果与讨论
• 3.2.1 AOT/Brij30反胶束介质中LiP的催化性能
• 2O₂的产生及控制方法'>3.2.2 反胶束介质中H₂O₂的产生及控制方法
• 3.2.3 染料降解
• 3.3 结论
• 参考文献
• 第四章 过氧化氢调控藜芦醇介导木素过氧化物酶催化氧化邻苯三酚红研究
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 仪器与试剂
• 4.1.2 LiP酶的制备
• 4.1.3 LiP催化氧化PR反应波长扫描动力学图谱的绘制
• 4.1.4 LiP催化氧化PR反应初速率的测定
• 4.2 结果与讨论
• 2O₂对PR氧化产物的调控'>4.2.1 H₂O₂对PR氧化产物的调控
• 4.2.2 VA对PR氧化的促进作用
• 4.2.3 VA的介导机制
• 4.3 结论
• 参考文献
• 第五章 反胶束中藜芦醇介导木素过氧化物酶催化氧化邻苯三酚红反应的机制研究
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 仪器与试剂
• 5.1.2 反胶束溶液的配制（一般步骤）
• 5.1.3 LiP酶的制备及浓度的测定
• 5.1.4 LiP催化氧化VA、PR反应初速率测定方法
• 5.1.5 LiP催化氧化PR反应全波长扫描动力学图谱的绘制
• 2O₂存在下稳定性的影响'>5.1.6 VA和PR对LiP在H₂O₂存在下稳定性的影响
• 5.1.7 Selwyn实验
• 5.2 结果与讨论
• 5.2.1 LiP催化氧化PR反应研究
• 5.2.1.1 PR浓度对LiP催化氧化PR反应的影响
• 2O₂浓度的影响'>5.2.1.2 H₂O₂浓度的影响
• 5.2.2 VA介导LiP催化氧化PR反应
• 5.3 结论
• 参考文献
• 第六章 TRP对LiP催化氧化芳香化合物的促进作用
• 6.1 材料与方法
• 6.1.1 仪器与试剂
• 6.1.2 LiP酶的制备及浓度的测定
• 6.1.3 波长扫描动力学图谱的绘制
• 6.1.4 LiP催化氧化反应初速率的测定
• 2O₂抑制浓度的测定'>6.1.5 LiP催化氧化PR反应中H₂O₂抑制浓度的测定
• 6.1.6 不同PR浓度下LiP催化氧化TRP反应A240—t曲线的绘制
• 6.1.7 LiP催化氧化PR反应时几个波长下的A—t曲线
• 6.1.8 抑制时间的测定
• 6.2 结果与讨论
• 6.2.1 色氨酸被LiP催化氧化反应研究
• 6.2.2 TRP对具有不同氧化还原电位的芳香化合物的介导作用
• 6.2.3 TRP对LiP催化氧化PR反应的促进作用
• 6.3 结论
• 参考文献
• 第七章 介质对芳香化合物阳离子自由基寿命的影响
• 7.1 材料与方法
• 7.1.1 仪器与试剂
• 7.1.2 自由基吸收光谱的记录
• 7.1.3 各自由基衰减动力学曲线的绘制及衰减速率常数的计算
• 7.1.4 不同反应条件下苯酚自由基衰减速率的测定
• 0下,Brij30反胶束介质中苯酚自由基衰减动力学常数测定'>7.1.5 不同ω₀下,Brij30反胶束介质中苯酚自由基衰减动力学常数测定
• 7.1.6 不同介电常数介质中苯酚自由基衰减动力学常数的测定
• 7.1.7 酶法产生苯酚阳离子自由基及其衰减速率常数的测定
• 7.2 结果与讨论
• 7.2.1 水介质中自由基衰减动力学研究
• 7.2.2 Brij30反胶束中酚氧自由基衰减动力学研究
• 7.3 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读博士学位期间发表学术论文
• 附件
• 学位论文评阅及答辩情况表