GPERshRNA表达载体的构建及其对血管内皮细胞增殖的影响

论文摘要

目的：构建人和小鼠共用的G蛋白偶联雌激素受体（G-protein-coupled receptor 30, GPER）短发夹RNA（short hairpin RNA, shRNA）真核表达质粒,鉴定其对人血管内皮细胞（Human vascular endothelial cells, HVECs）和小鼠血管内皮细胞（mouse vascular endothelial cells, MVECs）GPER表达的影响,并观察其对人与小鼠血管内皮细胞增殖的影响。方法：设计并体外合成靶向（人和小鼠）基因GPER的特异性编码短发卡RNA （short hair RNA,shRNA）序列的寡核苷酸,同时合成一对错义的非特异性序列作为阴性对照,退火,连接到经限制性核酸内切酶BglⅡHindⅢ酶切处理的线性化pSUPER质粒中,转化感受态大肠杆菌,挑取阳性克隆,抽提重组质粒,进行EcoRⅠ> HindⅢ双酶切电泳及测序鉴定,构建shRNA重组质粒；培养人与小鼠的血管内皮细胞（vascular endothelial cells,ECs）,进而将构建的三组重组质粒用脂质体法分别转染人和小鼠的血管内皮细胞,蛋白质印迹（Western blot）检测各组GPER蛋白水平的表达,用MTT法检测构建重组质粒对人血管内皮细胞及小鼠血管内皮细胞增殖的影响。结果：GPER shRNA重组质粒经酶切及测序分析表明：目的核苷酸序列成功插入了预计位点且序列完全一致；转染了GPER shRNA质粒的人血管内皮细胞和小鼠血管内皮细胞,与对照组相比均可下调GPER蛋白的表达（P<0.05）,其中GPER shRNA2质粒的抑制作用较强,转染48 h后GPER蛋白的抑制率可最高可达到84.2%；构建的重组质粒转染人与小鼠血管内皮细胞后,可显著抑制（人与小鼠）血管内皮细胞的增殖。结论：成功构建同时靶向人和小鼠GPER的RNA干扰重组载体；构建成功的重组质粒可有效抑制人血管内皮细胞与小鼠血管内皮细胞中GPER蛋白的表达；构建的重组质粒转染人与小鼠血管内皮细胞,可显著抑制人与小鼠血管ECs的增殖,为后期的多项研究奠定基础,提供重要的工具。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一部分 GPERshRNA表达载体的构建和鉴定
• 第1章 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 实验菌种、质粒及细胞
• 1.1.2 主要仪器
• 1.1.3 主要试剂
• 1.1.4 互补64nt寡核苷酸单链序列的设计
• 1.1.5 质粒pSUPER的PCR上下游引物序列
• 1.1.6 主要药物、试剂及试剂的配制
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 重组质粒的构建
• 1.2.2 重组质粒的功能鉴定
• 1.3 统计分析
• 第2章 结果
• 2.1 酶切鉴定
• 2.2 测序鉴定
• 2.3 重组pSUPER-GPER质粒转染VEC
• 2.4 转染的血管内皮细胞株中GPER蛋白的表达
• 第3章 讨论
• 参考文献
• 第二部分 GPER-shRNA重组质粒对血管内皮细胞增殖的影响
• 第1章 试验方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 主要试剂
• 1.1.2 主要仪器
• 1.1.3 主要试剂的配置
• 1.2 试验方法
• 1.2.1 实验分组
• 1.2.2 血管内皮细胞的培养
• 1.2.3 MTT实验步骤
• 1.2.4 统计学方法
• 第2章 结果
• 2.1 pSUPER/GPER shRNA对血管内皮细胞增殖的影响
• 第3章 讨论
• 3.1 GPER
• 3.2 血管内皮细胞对心血管疾病产生的重要影响
• 3.3 雌激素与血管内皮细胞的关系
• 3.4 GPER与血管内皮细胞的关系
• 参考文献
• 结论
• 致谢
• 攻读硕士学位期间研究成果
• 综述
• 参考文献