白僵菌硝酸盐还原酶缺陷型突变体的筛选与鉴定

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白僵菌是一种重要的虫生生防真菌,在害虫防治中有着广泛的应用,目前其菌种改良的首选方法是基因工程育种,而筛选安全标记对获得工程菌的释放和推广有着重要意义。构建白僵菌硝酸盐还原酶缺陷型突变体,以此为转化受体,通过硝酸盐为唯一氮源筛选转化子,可以避免引入任何外源筛选标记,使转基因生物更安全。本研究采用两种诱变方法获得白僵菌不利用硝酸盐突变体,分别为甲基磺酸乙酯（EMS）诱变原生质体和氯酸盐培养基（WAC）诱变菌丝。EMS诱变原生质体方法中对EMS处理浓度和处理时间进行了优化,其最佳条件为20μl EMS处理时间为1h至2h;诱变原生质体通过富集培养后获得突变体149株;149株突变体经过氮源筛选获得不利用硝酸盐突变体88株。88株突变体在硝酸盐培养基上连续培养7代后得到稳定不利用硝酸盐突变体（nit1）菌株为68株,稳定率为66%～87%之间,属于nit1;nit1突变体生理表现型为不利用硝酸盐,利用亚硝酸盐和次黄嘌呤;稳定的突变体硝酸盐还原酶活性与野生型相比显著降低,最低为139.13μg/g.h,是野生型菌株硝酸盐还原酶酶活性的三分之一。同时,EMS诱变获得的88个突变体中,在10μl EMS处理2h原生质体得到4株突变体除不利用硝酸盐外,完全不利用亚硝酸盐,利用次黄嘌呤,与前人报道突变体生理表现不一致,为新发现表型,暂命名为nitX。WAC方法诱变获得35株突变体,通过MM培养基培养筛选到21株不利用硝酸盐突变体,其生理表现型为不利用硝酸盐,利用亚硝酸盐和次黄嘌呤;21株突变体在硝酸盐培养基上连续培养7代后共获得稳定不利用硝酸盐突变体（nit1）菌株19株,稳定率达90.47%;稳定突变体硝酸盐还原酶活性为154.47μg/g.h,比野生型菌株降低了226.61μg/g.h。通过PCR、测序、BLAST及DNAMEN对硝酸还原酶活性最低的稳定突变体菌株（编号20-2-17）进行硝酸还原酶基因序列分析。PCR结果表明野生型和编号20-2-17突变体菌株均扩增出硝酸还原酶基因为0.5kb、2.8kb和3.5kb片段,选择2.8kb片段测序、BLAST分析表明编号20-2-17突变体硝酸还原酶基因与虫草白僵菌的硝酸还原酶基因同源性为99%,具有相同的4个保守结构域;与野生型硝酸还原酶氨基酸比对表明:位于保守域中黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）结构域中695处T（苏氨酸）突变为K（赖氨酸）,位于保守域中次黄嘌呤（NAD）核苷酸结构域中787处S（丝氨酸）变突变为C（胱氨酸）,789处A（丙氨酸）变突变为V（缬氨酸）。保守区域蛋白的置换至使硝酸还原酶蛋白组成失活导致其他电子传递链受到影响,确切原因是次黄嘌呤脱氧化酶（NAD）和黄素腺嘌呤脱氧化酶（FAD）活性失活,进步控制黄素腺嘌呤二核苷酸脱氧化酶（FADH2）和甲基紫酯还原酶活性,造成菌株不能利用硝酸盐。结合突变体生理表现与基因序列分析,进一步说明编号20-2-17突变体为不利用硝酸突变体。本实验初步建立了球孢白僵菌NR缺陷突变体菌株的诱变、筛选和鉴定方法,为获得更详细的突变体信息,还需要对突变体进行进一步的筛选鉴定,为最终利用NR基因建立球孢白僵菌专用筛选标记奠定基础。

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摘要

Abstract

第一章引言

1.1 白僵菌的分类和生物学特征

1.1.1 白僵菌的分类

1.1.2 白僵菌的生物学特性

1.1.3 白僵菌的应用

1.1.4 白僵菌育种研究进展

1.2 白僵菌的分子生物学研究进展

1.2.1 白僵菌遗传转化方法

1.2.2 选择标记基因

1.3 硝酸盐还原酶代谢途径研究

1.3.1 NR的结构类型与特性

1.3.2 硝酸还原酶基因遗传机制应用

1.3.3 硝酸还原酶在真菌的研究

1.4 研究目的与意义

1.5 主要研究内容与实验设计

第二章 EMS诱变球孢白僵菌

2.1 材料

2.1.1 菌株

2.1.2 供试主要试剂

2.1.3 供试仪器

2.1.4 供试培养基和溶液

2.2 方法

2.2.1 原生质体制备方法

2.2.2 EMS诱变球孢白僵菌原生质体

2.2.3 富集培养

2.2.4 突变体筛选

2.2.5 突变体生理表现型鉴定

2.2.6 突变体稳定性鉴定

2.3 结果与分析

2.3.1 突变体富集结果

2.3.2 突变体筛选结果

2.3.3 突变体生理鉴定结果

2.3.4 突变体稳定性

第三章 WAC诱变球孢白僵菌

3.1 材料

3.1.1 菌株

3.1.2 供试培养基

3.2 方法

3.2.1 WAC诱变球孢白僵菌

3.2.2 鉴定诱变的白僵菌

3.2.3 突变体生理表现型鉴定

3.2.4 突变体稳定检测

3.3 结果与分析

3.3.1 WAC诱变结果

3.3.2 突变体的稳定检测

第四章硝酸还原酶活性的检测

4.1 材料

4.1.1 供试菌株

4.1.2 供试主要试剂

4.1.3 供试仪器

4.2 方法

4.2.1 硝酸还原酶测定原理和方法

4.2.2 标准曲线制作

4.2.3 突变体硝酸还原酶活力测定

4.3 结果与分析

4.3.1 硝酸还原酶活性

第五章突变体分子生物学分析

5.1 材料

5.1.1 供试菌株

5.1.2 供试试剂

5.1.3 主要仪器

5.2 方法

5.2.1 总DNA的提取

5.2.2 突变体PCR扩增

5.3 结果与分析

5.3.1 PCR扩增片段

5.3.2 序列测定结果

第六章结论与讨论

6.1 EMS诱变结果

6.1.1 不利用硝酸盐突变体的筛选和鉴定

6.1.2 不利用硝酸盐新突变体的鉴定

6.2 WAC方法诱变结果

6.3 EMS诱变方法和WAC诱变方法的比较

6.4 硝酸还原酶活性

6.5 PCR结果分析

6.6 序列分析

6.7 应用价值

6.8 试验中存在的问题及下一步研究方向

参考文献

附录

致谢

作者简历

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