小鼠胚胎干细胞中SUMO修饰对Nanog调控作用研究

论文摘要

SUMO修饰是真核细胞内广泛存在的一种翻译后修饰途径,调节细胞内多种蛋白的功能、稳定性和亚细胞定位。Nanog基因是维持胚胎干细胞多能性和自我更新的关键基因,为了阐明SUMO修饰对Nanog基因的调控作用,本研究以F9畸胎瘤细胞为模型,利用实时定量PCR（Real time PCR）、免疫印迹（Western blot）、双荧光素酶报告基因分析（Dual-Luciferase Reporter assay）、免疫荧光染色等方法,从不同角度研究了SUMO修饰对Nanog基因的影响。实验结果如下:1.利用重叠延伸PCR（Overlap Extension PCR,OE PCR）方法,克隆小鼠Nanog基因启动子区-230—+50bp序列和Oct4/Sox2元件突变的序列,分别将野生型和突变体启动子片段插入荧光素酶报告基因载体pGL4.10中,构建Nanog启动子荧光素酶报告基因载体pGL4-230 luc,pGL4-230 Soxmut luc,pGL4-230 Octmut luc和pGL4-230 Octm/Soxm luc。测序结果证明构建的载体序列与预期结果一致。用上述载体分别转染多能性的F9畸胎瘤细胞和小鼠胚胎成纤维细胞NIH3T3,双荧光素酶报告基因分析检测启动子活性。结果表明,本实验中克隆到的启动子片段为Nanog有效启动子,能有效启动下游基因的转录并具有组织特异性。2.本研究证明了SUMO修饰抑制Nanog表达。一方面通过RNAi敲降SUMO1和Ubc9,另一方面过表达SUMO1和Ubc9,F9细胞内蛋白整体SUMO修饰水平呈现出差异。利用实时定量PCR、免疫印迹、双荧光素酶报告基因分析检测不同SUMO修饰水平下Nanog转录水平、翻译水平的变化。结果发现细胞处于高度SUMO修饰状态时,Nanog表达水平低;相反,低SUMO修饰状态的F9细胞Nanog表达水平升高,表明SUMO修饰抑制Nanog表达。3.分别使用野生型Oct4、SUMO修饰位点突变体Oct4 K118R真核表达载体与SUMO修饰系统组分SUMO1和Ubc9表达载体共转染F9细胞,检测Nanog转录水平和翻译水平的差异,结果表明SUMO修饰Oct4促进Nanog表达。采用相同的方法研究SUMO修饰Sox2对Nanog表达的影响,即用野生型pCMV-HA-Sox2、SUMO修饰位点突变体pCMV-HA-Sox2 K247R与SUMO修饰系统组分SUMO1和Ubc9表达载体共转染F9细胞,实时定量PCR、免疫印迹、双荧光素酶报告基因分析检测在不同SUMO修饰状态的Sox2细胞中Nanog表达量的变化。实验结果表明:与Oct4相反,SUMO修饰Sox2抑制Nanog表达。4.SUMO常通过影响蛋白质的亚细胞定位、改变蛋白质分子间相互作用界面来调节底物蛋白的功能。为进一步阐明SUMO修饰抑制Nanog表达的分子机理,本实验利用红色荧光蛋白报告基因载体和免疫荧光染色等方法研究SUMO修饰对Oct4和Sox2亚细胞分布情况的影响。即用pDSRed-Oct4、pDSRed-Oct4 K118R和pCMV-HA-SUMO1、pCMV-HA-Ubc9共转染F9细胞,荧光显微镜下观察野生型Oct4和不能被SUMO修饰的Oct4 K118R在细胞中的分布,结果发现Oct4和Oct4 K118R都定位在细胞核中,SUMO修饰不影响Oct4在F9细胞中的分布。野生型pCMV-HA-Sox2和SUMO修饰突变体载体pCMV- HA-Sox2 K247R与pCMV-HA-SUMO1、pCMV-HA-Ubc9共转染F9细胞后,免疫荧光染色检测Sox2和Sox2 K247R的亚细胞定位。结果表明SUMO修饰未改变Sox2的亚细胞定位,Sox2和Sox2 K247R一样,都定位在细胞核中。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 Nanog 基因研究进展
• 1.1.1 Nanog 基因的发现及生物学意义
• 1.1.2 Nanog 基因、蛋白结构特点
• 1.1.3 Nanog 作为转录因子的功能及自身表达调控研究进展
• 1.2 SUMO 修饰研究进展
• 1.2.1 SUMO 修饰途径及功能
• 1.2.2 SUMO 修饰与Oct4、Sox2 的关系
• 1.3 研究目的、内容及意义
• 第二章 Nanog 基因启动子报告基因载体构建及功能鉴定
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 方法
• 2.2 结果
• 2.2.1 启动子片段的克隆和定点突变
• 2.2.2 重组子双酶切鉴定
• 2.2.3 双荧光素酶报告基因分析
• 2.3 讨论
• 2.3.1 荧光素酶报告基因载体构建
• 2.3.2 双荧光素酶报告基因分析实验
• 第三章 SUMO 修饰对Nanog 调控作用研究
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 方法
• 3.2 结果
• 3.2.1 RNA 干扰效率的验证
• 3.2.2 不同 SUMO 修饰水平对细胞 Nanog 表达的影响
• 3.2.3 SUMO 修饰对Nanog 近端启动子转录活性的影响
• 3.3 讨论
• 3.3.1 RNA 干扰 SUMO1、Ubc9 基因的敲降效率检测
• 3.3.2 SUMO 修饰对Nanog 基因的调控
• 3.3.3 SUMO 修饰对Nanog 启动子活性的影响
• 第四章 SUMO 修饰Oct4、Sox2 对Nanog 表达的影响
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 方法
• 4.2 结果
• 4.2.1 SUMO 修饰Oct4 上调Nanog 的表达
• 4.2.2 SUMO 修饰Sox2 下调Nanog 的表达
• 4.2.3 SUMO 修饰 Oct4、Sox2 对 Nanog 启动子活性的影响
• 4.3 讨论
• 4.3.1 SUMO 修饰 Oct4 对 Nanog 表达的影响
• 4.3.2 SUMO 修饰 Sox2 对 Nanog 表达的影响
• 第五章 SUMO 修饰对 Oct4 和 Sox2 亚细胞定位的影响
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 材料
• 5.1.2 方法
• 5.2 结果
• 5.2.1 SUMO 修饰对 Oct4 亚细胞定位的影响
• 5.2.2 SUMO 修饰对 Sox2 亚细胞定位的影响
• 5.3 讨论
• 第六章 讨论与结论
• 6.1 讨论
• 6.2 全文结论
• 参考文献
• 英文缩略词表
• 致谢
• 作者简介