PPV SC-1株VP2蛋白Cys-402、214的定点突变及其对PPV VLPs影响的初步研究

论文摘要

本研究以PPV VP2为基础,通过定点突变的方法研究了Cys在VLPs高级结构和免疫原性中的作用,旨在寻找利于外源基因插入的位点,为以PPV VLPs为基础的多价疫苗和抗原转运系统的研究提供理论基础。方法:根据GenBank中PPVVP2（Genbank登录号:D00623）序列设计并合成突变引物和克隆引物,利用重叠延伸PCR技术分别将PPV VP2蛋白中第402位（A）和214位（B）的半胱氨酸突变为精氨酸。将得到的突变产物VP2（A）和VP2（B）分别插入真核表达载体pPI-2.EGFP中,构建含有突变产物和报告基因EGFP的真核表达质粒pPI-2.EGFE VP2（A）和pPI-2.EGFE VP2（B）。将重组质粒转染COS-7细胞,研究突变对PPV VLPs形成的影响。同时将重组质粒分别免疫Balb/c小白鼠,监测外周血中T淋巴细胞及血清中PPV抗体的动态变化,探讨突变对PPV VLPs免疫原性的影响。通过电镜技术对表达产物进行观察,结果只在转染质粒pPI-2.EGFP.VP2（A）的细胞中见到许多VLPs,证明Cys-214对VLPs的形成至关重要,而Cys-402的突变不会影响VLPs的包装;在免疫小白鼠外周血T淋巴细胞的监测和血清中特异性抗体的检测中发现,质粒pPI-2.EGFP.VP2（B）的免疫效果明显低于pPI-2.EGFEVP2（A）,并且仅在免疫了质粒pPI-2.EGFEVP2（A）的小白鼠血清中检测到较高水平的PPV特异性抗体,说明Cys-402的突变不仅不影响VLPs的正确组装,也不影响其免疫原性的发挥,可以推测,在该位点插入外源基因可能不影响VLPs的组装,因此该位点及其附近是一个潜在的外源基因插入位点,值得深入研究。同时也进一步证实了VLPs的完整性是保证其免疫原性的关键因素。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1 猪细小病毒的研究进展
• 1.1 猪细小病毒病的发生与流行特点
• 1.2 PPV的一般生物学特性
• 1.3 猪细小病毒分子生物学研究进展
• 1.3.1 PPV基因组特点
• 1.3.2 PPV基因组的转录
• 1.3.3 PPV基因组产物
• 1.4 猪细小病毒病疫苗研究进展
• 1.4.1 灭活苗
• 1.4.2 弱毒疫苗
• 1.4.3 PPV基因工程疫苗
• 2 病毒样颗粒研究进展
• 2.1 病毒样颗粒的来源
• 2.2 病毒样颗粒的应用
• 2.2.1 VLPs在基础研究中的应用
• 2.2.2 VLPs在载体设计中的应用
• 2.2.3 VLPs在疫苗设计中的应用
• 2.2.4 VLPs在免疫测定中的应用
• 3 本研究的目的和意义
• 第二章 试验研究
• 1 试验材料
• 1.1 质粒、菌株及细胞
• 1.2 主要药品与试剂
• 1.3 引物的设计与合成
• 1.4 培养基
• 1.5 主要溶液的配制
• 1.6 试验动物
• 1.7 主要仪器
• 2 试验方法
• 2.1 VP2基因的定点突变和突变体的克隆
• 2.1.1 质粒pVP2的获得
• 2.1.2 质粒pVP2的酶切鉴定
• 2.1.3 VP2基因的定点突变
• 2.1.4 pVP2（A）和pVP2（B）的构建
• 2.2 真核表达载体pPI-2.EGFP.VP2（A）、pPI-2.EGFP.VP2（B）的构建
• 2.2.1 质粒pPI-2.EGFP与pPVP2（A）、pPVP2（B）的获得
• 2.2.2 质粒pPI-2.EGFP与pPVP2（A）、pPVP2（B）的酶切回收
• 2.2.3 回收产物的连接
• 2.2.4 感受态E.coli DH5α细胞的制备
• 2.2.5 连接产物的转化
• 2.2.6 重组质粒的鉴定
• 2.3 重组质粒转染COS-7细胞
• 2.3.1 pPI-2.E6FP.VP2（A）、pPI-2.EGFP.VP2（B）质粒DNA的小量抽提与纯化
• 2.3.2 细胞的复苏与传代
• 2.3.3 重组质粒DNA的转染
• 2.4 超薄切片电镜观察
• 2.5 重组突变体的部分生物学特性研究
• 2.5.1 重组质粒的大量抽提及纯化
• 2.5.2 试验动物分组
• 2.5.3 免疫后小鼠T淋巴细胞数量的动态变化检测
• 2.5.4 PPV抗体检测
• 3 结果
• 3.1 VP2基因的定点突变和突变体的克隆
• 3.1.1 质粒pVP2双酶切鉴定
• 3.1.2 VP2基因的定点突变
• 3.1.3 pVP2（A）和pVP2（B）的构建
• 3.2 质粒pPI-2.EGFP.VP2（A）、pPI-2.EGFP.VP2（B）的双酶切与PCR鉴定
• 3.3 重组质粒转染后的荧光观察
• 3.4 超薄切片电镜观察
• 3.5 重组突变体的部分生物学特性研究
• 3.5.1 免疫后小鼠T淋巴细胞数量的动态变化检测
• 3.5.2 PPV抗体检测
• 4 讨论
• 4.1 半胱氨酸在PPV VLPs结构和功能中的作用
• 4.2 关于PPV VLPs的构建
• 4.3 关于重叠延伸PCR定点突变技术
• 4.4 关于宿主细胞的确定
• 4.5 关于转染
• 4.6 重组质粒核酸疫苗的免疫原性
• 4.6.1 免疫途径的确定
• 4.6.2 重组质粒的免疫应答
• 5 结论
• 参考文献
• 致谢