论文摘要
肿瘤含氧量（tumor oxygenation）在肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移的过程中发挥着巨大的作用。生理状态下，绝大多数的肿瘤细胞处于低氧状态（hypoxia）并且发生许多功能性的改变。低氧诱导因子（hypoxia-inducible factors，HIFs）作为一种对氧气敏感的转录因子超家族（transcription factor super family），主要负责众多的低氧诱导基因的表达调控。HIFs主要由三个成员组成：HIF-1、HIF-2（Endothelial PAS domain protein 1，EPAS1）和HIF-3（Inhibitory PAS protein，IPAS）。活化的HIF是由HIF-αand HIF-β亚基构成的异二聚体，前者是氧气敏感的亚基，在常氧条件下极不稳定；后者，也被称作ARNT（arylhydrocarbon receptornuclear translocator）是组成性表达的。HIF-1α主要包含5个功能结构域：bHLH（basichelix-loop-helix）、PAS（PER-ARNT-SIM）、NAD（N-terminal activation domain）、CAD（C-terminal activation domain）及ODD（oxygen-dependent degradation）结构域。bHLH结构域不仅对于HIF1与DNA的结合是必需的，同时还与PAS结构域一起参与同HIF-1b亚基的结合。NAD和CAD结构域主要发挥其转录调控功能，与NAD结构域部分重叠的ODD结构域主要负责翻译后修饰，对于HIF-1α的蛋白稳定性具有重要的调节作用。已知，HIF-1α蛋白ODD结构域的两个脯氨酸位点（Pro402和Pro564）可以被羟基化酶超家族PHDs（prolyl hydroxylase domain-containing proteins）羟基化修饰（hydroxylation）。羟基化修饰的HIF-1a蛋白易于与特异的E3泛素连接酶VHL（Von Hippel-Lindau）相结合，从而通过泛素蛋白酶体途径降解，这也是低氧诱导因子HIF-1a蛋白在常氧下极不稳定的主要因素。除了羟基化修饰，HIF-1a还可以进行磷酸化（phosphorylation）、乙酰化（acetylation）和S-nitrosylation等修饰，这些不同的修饰状态对HIF-1a的生物活性及稳定性具有重要的影响。就乙酰化而言，ARD1（arrest-defective-1 protein）作为一种乙酰化酶，首先被发现可以在小鼠肿瘤细胞内乙酰化HIF-1a蛋白ODD结构域的赖氨酸位点（Lys532），导致其蛋白水平的下降。然而，随后的研究表明，过表达ARD1质粒或者干扰内源性ARD1的表达，在人肿瘤细胞中对于HIF-1a的蛋白稳定性却没有任何影响。所以，在人肿瘤细胞中，何种乙酰化酶介导HIF-1a的乙酰化修饰目前还不清楚。2007年末，通过酵母双杂交的筛选，Semenza博士的研究小组于发现了两个新型的乙酰化酶SSAT1和SSAT2（spermidine/spermine-N-acetyltransferase-1/2）参与了人肿瘤细胞内HIF-1a蛋白的降解过程。虽然该研究小组没有得到SSAT1或者SSAT2可以直接乙酰化HIF-a的证据，但其研究表明，SSAT1和SSAT2的乙酰化酶活性对于其介导HIF-1a的降解是必需的。另一方面，组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylases，HDACs）也被报道参与了HIF-1a蛋白可逆的乙酰化修饰。HDAC1可以去乙酰化HIF-1a，阻止其进入MTA1（metastasis-associated protein 1）调节的降解过程。另外，干扰HDAC4的表达可以增加HIF-1a的乙酰化水平，从而导致其降解。CHIP（carboxyl terminus of Hsc70-interacting protein），也被称作STUB1（STIP1homology and U-box containing protein 1），是一种与分子伴侣蛋白（chaperones）功能密切相关的一类E3泛素连接酶。许多蛋白被报导了可以被CHIP通过泛素蛋白酶体途径降解，例如ErbB2、p53、tau和ER等。CHIP主要包含3个功能结构域：一个TPR（tetratricopeptide repeat）结构域位于氨基端，其主要负责与热休克蛋白Hsp90（heat shock protein 90）和热休克结合蛋白Hsc70（heat shockcognate 70）结合，发挥其分子伴侣蛋白功能；一个U-box结构域位于碳末端，其主要负责与降解底物结合，从而发挥其E3泛素连接酶功能；一个含有两个潜在入核信号的linker位于中间，可能主要负责CHIP的细胞内定位。作为Hsp90的底物蛋白，Hsp90对于维持HIF-1a的蛋白稳定性具有重要的作用。在低氧条件下，当Hsp90的功能受到抑制（如Hsp90抑制剂的应用），HIF-1a与Hsp90分离，同时与RACK1（receptor for activated C kinase）结合，其介导HIF-1a通过VHL非依赖的泛素蛋白酶体通路降解。由于目前还未有报道是否RACK1具有E3泛素连接酶活性，所以何种E3泛素连接酶参与了这一过程，目前还不是很清楚。另一方面，已有的研究表明，CHIP蛋白的E3泛素连接酶功能主要与分子伴侣蛋白Hsp90和Hsc70密切相关。除此之外，CHIP的E3泛素连接酶功能还与E2泛素结合酶，UBC4/5超家族相关。由于UBC4/5超家族有着应激激活（stress-activated）的特性，因此，在不同的应激状态下，CHIP有可能在分子伴侣复合物（chaperonecomplexes）到分子伴侣依赖的降解复合物的转变过程中发挥着重要的作用。在常氧的情况下，由于羟基化酶PHD和E3泛素连接酶VHL的存在，在人肿瘤细胞中，HIF-1a几乎不表达；在低氧条件下，由于氧敏感的羟基化酶PHD的失活，导致了HIF-1a与E3泛素连接酶VHL的分离，从而HIF-1a可以稳定地表达，发挥其转录因子的调控作用。有趣的是，HIF-1a的表达在低氧的条件下也不是一成不变的：HIF-1a在严重低氧（severe hypoxia）或者延迟低氧（prolonged hypoxia）的条件下也可以发生不同程度的降解。在严重低氧（severe hypoxia）的情况下，p53蛋白可以通过抑制HIF-1a的转录活性，来降低HIF-1a的蛋白水平，而MDM2（murine double minutes 2）则以直接或者间接的方式参与p53调节的HIF-1a的降解。已有研究证明，在HepG2肿瘤细胞中，与急性低氧（acute hypoxia，5小时，1% O2）处理相比较，延迟低氧处理（16小时，1% O2）可以明显地下调HIF-1a的蛋白水平；在A549肿瘤细胞中，HIF-1a同样在急性低氧（4小时，0.5%O2）条件下稳定表达，但在延迟低氧的条件下，表达水平却明显地下降（6-12小时，0.5% O2）。蛋白合成和蛋白降解同时参与了这一生理过程。一方面，延迟低氧可以抑制细胞蛋白合成调节者mTOR（mammalian target of rapamycin）的活性，通过抑制HIF-1a的蛋白合成来降低它的表达水平；另一方面，在延迟低氧的条件下，随着HIF-1a转录活性的增加，HIF-1a自身可以形成一种负反馈环路（negativefeedback loop）来下调HIF-1a蛋白的表达，该降解途径是VHL和PHD非依赖的，而乙酰化修饰对于这条负反馈环路的降解作用却有着明显的正相关性。与常氧条件下，E3泛素连接酶VHL调节HIF-1a的降解已经广为人知所不同的是，哪种E3泛素连接酶参与了延迟低氧中HIF-1a的降解还不清楚。在本研究中，我们报导了作为一种与分子伴侣蛋白密切相关的E3泛素连接酶，CHIP参与了延迟低氧条件下HIF-1a的降解，同时还可以影响HIF-1a的转录活性，但对于HIF-1a的mRNA水平没有影响。通过应用p53和VHL缺失的细胞株以及RNA干扰实验，我们证实了延迟低氧条件下，CHIP介导HIF-1a的降解途径是VHL和p53/MDM2非依赖的。在延迟低氧的条件下，伴随着HIF-1a蛋白水平的下降，HIF-1a的乙酰化修饰和泛素化修饰都有着明显的增加，而CHIP可以通过与HIF-1a的直接结合，来促进HIF-1a的泛素化状态，加速HIF-1a的降解。随着低氧时间的延长，CHIP的表达水平有轻微的上调，并可以从细胞浆转位到细胞核内，实现与HIF-1a的共定位，从而介导HIF-1a的降解。通过蛋白酶体抑制剂MG132的应用，我们发现了延迟低氧条件下，CHIP介导HIF-1a的降解是通过泛素蛋白酶体通路实现的。同时，我们还发现了组蛋白去乙酰化酶HDAC1和HDAC2都参与了延迟低氧条件下HIF-1a的乙酰化修饰。通过RNA干扰实验和组蛋白去乙酰化酶抑制剂的应用，我们发现了HDAC1和HDAC2的抑制可以导致HIF-1a乙酰化水平的增加，增加CHIP和HIF-1a的直接结合，最终促进CHIP介导HIF-1a的降解过程。通过对于CHIP的功能结构域的分析，我们证实了其分子伴侣蛋白功能相关的TPR结构域和E3泛素连接酶功能相关的U-box结构域，不但对于CHIP介导的HIF-1a的降解都是必需的，而且对于CHIP抑制HIF-1a的转录激活功能也是必需的。通过对HIF-1a的功能结构域的分析，我们证实了只有HIF-1a的野生型全长质粒才可以被CHIP降解，而与乙酰化作用密切相关的ODD结构域缺失体，或者只表达ODD结构域及其乙酰化为点突变体，最终都无法被CHIP所降解。通过我们的研究，对于目前如何区分低氧诱导因子家族成员的功能这一难题，提出了一个新的观点。