论文摘要
研究背景与目的:慢性高血糖是糖尿病重要的临床特征,是胰岛β细胞功能障碍导致胰岛素分泌不足或（和）胰岛素作用异常的结果,然而,在高浓度葡萄糖刺激下,可以表现出葡萄糖毒性（糖毒性,glucosetoxicity）效应。研究结果表明慢性高血糖可以导致胰岛体积减小,并提出胰岛体积减小主要由β细胞凋亡增加引起,提示糖尿病患者的高血糖对诱导胰岛细胞凋亡起重要作用,从而破坏胰腺胰岛的专有结构与细胞增殖和凋亡之间的平衡,在临床上表现为胰岛功能减退甚至衰竭,改变了机体内分泌的微环境。进一步研究发现,在胰岛生存的微环境的诸多因素中,肾素-血管紧张素系统（Renin Angiotensin System,RAS）的作用也十分重要,有研究证实人和鼠、狗等啮齿类动物胰岛存在局部的RAS。其特点是胰岛局部RAS不依赖于肾脏,可以自身合成、释放肾素和血管紧张素,通过胞内分泌、旁分泌、自分泌方式在细胞水平发挥多种的生理及病理生理作用,包括:调整细胞生长、分化、增殖及凋亡,活性氧簇（Reactive Oxygen Species,ROS）的产生,组织炎症和纤维化,激素的分泌等。而一些大型临床试验如LIEF（Losartan Intervemion for Endpoints reduction in hypertension study）、SCOPE（the study on cognition and prognosis in the elderly）、CAPPP（theCaptopril Prevention Project）证实,使用血管紧张素转换酶抑制剂（Angiotensin-converting enzyme inhibitor,ACEI）、血管紧张素受体拮抗剂（Angiotensin receptor blocker,ARB）可以降低有高危因素个体新发2型糖尿病的风险,具体机制尚不清楚,但提示胰岛功能和RAS有关。有研究认为高血糖（糖毒性）和高血脂（脂毒性）、超重和肥胖、炎症及氧化应激可以激活RAS,其效应可能是激活的RAS通过影响胰岛的血流、还原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（NADPH氧化酶）、氧化应激而损害胰岛结构和功能。动物研究也提示,一些肥胖的2型糖尿病（Type 2 Diabetesmellitus,T2DM）的动物模型,使用ACEI后其胰岛素分泌功能得到改善,氧化应激明显降低,并减少胰岛细胞凋亡,改善胰岛纤维化,但确切机制不清楚。因此,高血糖（高糖环境）、高血脂（高脂环境）、炎症及氧化应激因子、RAS等构成影响胰岛细胞微环境变化的主导因素,其结果常导致胰岛细胞的凋亡,而胰岛细胞微环境中高糖变化（糖毒性）与胰岛细胞凋亡是目前的研究重点。目前,关于高糖与胰岛细胞凋亡研究主要有动物模型、胰岛细胞模型（包括HIT-T15β细胞株,胰岛β细胞系MIN6,β细胞株NIT-1等）、原代分离胰岛细胞培养。前两种方法应用较多,各有优缺点。动物模型研究着重于整体状态,但其影响因素较多,表现为整个疾病的病理生理状态,分析较为复杂;胰岛细胞模型着重于单细胞水平,影响因素少,但目前的β细胞株对葡萄糖刺激与载体比较结果有较大差异,传代后功能不稳定限制了其应用;最理想的方法是原代分离胰岛细胞,但由于受胰岛细胞本身的易损伤性和目前分离技术水平所限,分离所得的胰岛细胞活性受较大的影响,对其离体存活和功能研究影响也较大,实际操作难度大。选择原代胰岛培养,是一种小器官体外培养,能较大程度保持胰岛细胞（尤其是β细胞）的生理功能,可施加独立的干预因素（如高糖、高脂等）,较精确与针对性地改变胰岛微环境条件,是目前离体状态下研究胰岛细胞（β细胞）的较理想体外模型。本试验采用手工挑取SD大鼠胰岛作为培养的研究对象,建立体外高浓度葡萄糖培养胰岛细胞凋亡的模型,观察高浓度葡萄糖的单一因素对SD大鼠胰岛细胞凋亡的影响,进一步研究干预因素（厄贝沙坦）对胰岛的影响及机制。本研究分为以下两部分:其一是体外高糖环境诱导SD大鼠胰岛细胞凋亡模型建立,其二是厄贝沙坦（特异的血管紧张素Ⅱ1型受体（AT1R）拮抗剂）对体外高糖培养SD大鼠胰岛细胞凋亡的影响及机制。为临床保护胰岛功能和降低糖毒性提供实验基础,为糖尿病的防治提供理论依据。材料与方法:根据实验设计分两部分,第一部分为建立体外高糖环境诱导SD大鼠胰岛细胞凋亡模型:手工挑取健康雄性SD大鼠胰岛分组培养,每组6个样本,每个样本20个胰岛,按培养液中葡萄糖的浓度和培养时间的不同分为六组:NG1组（葡萄糖5.6mmol/L培养24h）、NG2组（葡萄糖5.6mmol/L培养72h）、NG3组（葡萄糖5.6mmol/L培养120h）;HG1组（葡萄糖25.6mmol/L培养24h）、HG2组（葡萄糖25.6 mmol/L培养72h）、HG3组（葡萄糖25.6 mmol/L培养120h）。第二部分为厄贝沙坦对体外高糖培养SD大鼠胰岛细胞凋亡的影响及机制实验:在体外高糖培养SD大鼠胰岛细胞凋亡模型的基础上,采用血清药理学实验制备厄贝沙坦血清,对胰岛细胞凋亡模型进行厄贝沙坦血清干预试验,培养时间均为24h。按培养液中葡萄糖的浓度和是否用厄贝沙坦血清（A）干预分为四组:NG组（葡萄糖5.6mmol/L）、HG组（葡萄糖25.6 mmol/L）;NG+A组（葡萄糖5.6mmol/L+1ml厄贝沙坦血清）、HG+A组（葡萄糖25.6 mmol/L+1ml厄贝沙坦血清）。根据不同的实验目的,检测指标主要为,①TUNEL法检测胰岛细胞凋亡:按各培养时点收集各组胰岛,荧光显微镜下观察各组胰岛细胞凋亡情况,应用LEICA病理图像分析系统（DMR+Q550型）计算胰岛细胞凋亡率。②FQ-RT-PCR（逆转录-实时荧光定量PCR）法检测胰岛细胞凋亡相关基因（Caspase-3、Bax）、RAS成分（AT1R、AngⅡ-血管紧张素Ⅱ）的表达:用Trizol一步法提取胰岛细胞总RNA、进行cDNA合成和扩增,应用FQ-RT-PCR方法对各基因进行定量分析,通过连续检测整个PCR扩增过程中荧光信号强弱的变化,测定各组胰岛细胞中上述基因的起始模板量。③逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测胰岛细胞NADPH氧化酶亚型p22phox、gp91phox mRNA表达:Trizol一步法提取胰岛细胞总RNA,进行cDNA合成,RT-PCR反应扩增p22phox、gp91phox。④胰岛细胞氧化应激指标检测:使用比色法检测各组胰岛细胞TAOC、SOD、GSH、MDA的含量。⑤检测葡萄糖刺激胰岛素分泌:采用酶联免疫吸附试验法（ELISA）测定胰岛素浓度,胰岛素分泌水平以刺激比率计算。结果:第一部分体外高糖环境诱导SD大鼠胰岛细胞凋亡模型各组实验结果:①各组胰岛细胞凋亡率比较:HG1、HG2、HG3组与对照组（NG）相比,胰岛细胞凋亡率明显增高（P＜0.05）,HG2、HG3组与HG1组比较胰岛细胞凋亡率增高（P＜0.05）,HG3组与HG2组比较胰岛细胞凋亡率增高（P＜0.05）,随着时间延长HG各组胰岛细胞凋亡率逐渐增高;NG组间各组相比胰岛细胞凋亡率无显著性差异（P＞0.05）,但有逐渐升高趋势。②胰岛细胞凋亡相关基因Caspase-3结果:NG3组与NG1、2组比较,Caspase-3 mRNA表达量明显增高;HG各组Caspase-3 mRNA表达量均高于NG各组（P＜0.05）,且同组内比较均有差异（P＜0.05）。第二部分厄贝沙坦对体外高糖培养SD大鼠胰岛细胞凋亡的影响及机制实验结果:①荧光显微镜下观察HG组有较多绿色荧光（凋亡细胞细胞核）。各组胰岛细胞凋亡率:HG组与NG组比较,凋亡率明显增高（P＜0.05）;HG+A组与HG组比较凋亡率明显下降（P＜0.05）。②胰岛细胞凋亡相关基因表达:Bax、Caspase-3 mRNA表达,HG组高于NG组（P＜0.0005）;HG+A组与HG组比较,Bax、Caspase-3 mRNA表达明显下降（P＜0.0005）。③AT1R、AngⅡmRNA表达:AT1R、AngⅡmRNA表达,HG组高于NG组（P＜0.0005）;HG+A组与HG组比较,AT1R、AngⅡmRNA表达明显下降（P＜0.0005）。④NADPH氧化酶表达:p22phox、gp91phox mRNA表达,HG组高于NG组（P＜0.0005）;HG+A组与HG组比较,p22phox、gp91phox mRNA表达明显下降（P＜0.0005）。⑤胰岛细胞氧化应激检测:抗氧化能力指标（TAOC、SOD、GSH）、氧化损伤指标（MDA）在NG、HG组差异有统计学意义,HG组胰岛细胞抗氧化能力低于NG组,而氧化损伤高于NG组（p＜0.05）;HG+A组与HG组比较,抗氧化能力明显提高、氧化损伤降低（p＜0.05）。⑥葡萄糖刺激的胰岛素分泌:胰岛素分泌水平以刺激比率（刺激比率=15mmol/L葡萄糖刺激时胰岛素÷3.3mmol/L葡萄糖刺激时胰岛素）作为统计分析的指标。HG组刺激比率明显高于NG组（p＜0.0005）;HG+A组与HG组比较,无统计学差异（p＞0.05）,厄贝沙坦对胰岛素分泌没有影响。结论:①高糖促进体外培养SD大鼠胰岛细胞凋亡,通过RAS系统的AngⅡ介导NADPH氧化酶途径诱导ROS产生增加,同时激活凋亡相关基因Bax、Caspase-3 mRNA表达,可能是胰岛细胞凋亡的重要机制。②厄贝沙坦拮抗高糖环境中胰岛细胞凋亡,可能与抑制AT1R、AngⅡmRNA表达,阻断RAS通路,以及抗氧化和下调凋亡相关基因Bax、Caspase-3 mRNA的表达有关。③厄贝沙坦对体外高糖培养24h SD大鼠胰岛细胞胰岛素分泌功能无明显影响。