传统豆酱中米曲霉蛋白酶的分离纯化及其酶学性质分析

论文摘要

豆酱的发酵主要依赖米曲霉（Aspergillus oryzae）所产生的蛋白酶和淀粉酶的作用。米曲霉分泌的蛋白酶在水解原料使豆酱产生风味的过程中起了关键作用。为了更好的研究和利用米曲霉产生的蛋白酶,本文在对自主分离的米曲霉HDF-7的蛋白酶进行分离纯化基础上,研究其纯酶酶学性质,并利用该纯蛋白酶水解大豆蛋白和直接进行酶法制酱。通过这些研究,明确了该米曲霉所产蛋白酶的性质,摸索了该蛋白酶在生产上应用的可能性。本研究为蛋白酶的应用奠定了良好的理论基础,为工业制酱条件的进一步研究提供了理论依据,也对酶制剂市场的拓展提供了新的来源,因此具有很大的理论和实践意义。米曲霉HDF-7分离自农家大酱中,其所产蛋白酶经过70%硫酸铵沉淀和葡聚糖凝胶G50层析后达到电泳纯,经SDS-PAGE电泳得到单一条带并测定其相对分子质量约为30KDa。经N端氨基酸序列测定该蛋白酶起始12个氨基酸及比对后发现其与米曲霉（spergillus oryzae）RIB40 中性蛋白酶（ACCESSION:AAT68480）的N端序列具有高度相似性。对分离纯化后的蛋白酶进行酶学性质分析表明,其最适反应温度为50℃,最适作用pH值为7.0,该酶在20℃时具有良好的热稳定性,在pH 6.0～8.0的条件下酶是相对稳定的,Mn2+对该蛋白酶有明显的激活作用,Cu2+对该蛋白酶有强烈的抑制作用,Km值78 μg/mL,最大反应速度Vmax为6.29μg/min。大豆蛋白经该蛋白酶水解之后总氨基酸含量较酶解前增加了 18.2%,其中半胱氨酸、丙氨酸、缬氨酸、精氨酸含量有了明显的提高;采用原料直接加入蛋白酶代替制曲的方法,制得的豆酱与传统豆酱的外观、风味相差不大。该蛋白酶稳定性稍差,应保存在低温中性的环境中,其对大豆蛋白的水解效果较好,并在制酱过程中发挥了重要的作用。由此可以看出,本文成功分离纯化出了米曲霉的蛋白酶,可以为今后的生产应用奠定基础。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
• 1.1 蛋白酶简介
• 1.1.1 蛋白酶的分类
• 1.1.2 产蛋白酶的微生物
• 1.1.3 蛋白酶的应用
• 1.2 米曲霉蛋白酶
• 1.2.1 米曲霉概述
• 1.2.2 米曲霉产生酶类
• 1.2.3 米曲霉蛋白酶
• 1.2.4 米曲霉在食品工业中的应用
• 1.3 蛋白酶的纯化及酶学性质
• 1.3.1 蛋白酶的纯化
• 1.3.2 蛋白酶的酶学性质
• 1.4 蛋白酶在豆酱中的应用
• 1.4.1 大豆蛋白的组成与结构
• 1.4.2 蛋白酶在豆酱中的作用
• 1.4.3 酶法制酱
• 1.5 本课题的目的和意义
• 1.6 课题资助名称
• 1.7 本课题的技术路线
• 第2章 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 试剂
• 2.1.4 主要仪器设备
• 2.2 方法
• 2.2.1 分析方法
• 2.2.2 粗酶液的制备
• 2.2.3 不同培养时间对菌体产酶的影响
• 2.2.4 蛋白酶的分离纯化
• 2.2.5 纯蛋白酶的酶学性质研究
• 2.2.6 蛋白酶水解大豆蛋白的研究
• 2.2.7 酶法制酱初探
• 第3章 结果与分析
• 3.1 标准曲线的获得
• 3.1.1 酪氨酸标准曲线
• 3.1.2 牛血清蛋白标准曲线
• 3.2 蛋白酶分泌方式的确定
• 3.3 不同培养时间对菌体产酶的影响
• 3.4 蛋白酶的分离纯化
• 4）₂SO₄盐析饱和度的确定'>3.4.1 （NH₄）₂SO₄盐析饱和度的确定
• 3.4.2 Sephadex G-50层析
• 3.4.3 蛋白酶纯化得率
• 3.4.4 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 3.4.5 氨基酸序列分析
• 3.5 纯化蛋白酶的酶学性质分析
• 3.5.1 酶的最适反应温度
• 3.5.2 酶的最适反应pH
• 3.5.3 酶的热稳定性
• 3.5.4 酶的pH稳定性
• 4⁺对酶活性的影响'>3.5.5 金属离子、NH₄⁺对酶活性的影响
• 3.5.6 酪素浓度对蛋白酶水解速率的影响——米氏常数Km值的测定
• 3.6 蛋白酶水解大豆蛋白的研究
• 3.6.1 蛋白酶水解大豆蛋白后蛋白质降解的分析
• 3.6.2 氨基酸含量测定结果
• 3.7 酶法制酱初探
• 第4章 讨论
• 4.1 米曲霉蛋白酶的纯化
• 4.2 米曲霉蛋白酶的纯化过程中的样品处理
• 4.3 米曲霉蛋白酶的酶学性质分析
• 4.4 米曲霉蛋白酶水解大豆蛋白的研究
• 4.5 酶法制酱的研究
• 第5章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表学术论文