CpG-ODN对两种病原菌联合诱导的山羊实验性乳腺炎的保护研究

论文摘要

本文以泌乳初期的睢宁白山羊为研究对象,探讨了CpG-ODN对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌联合诱导的山羊实验性乳腺炎的作用,并对乳腺组织的二维凝胶电泳进行了初步的探索,为今后的深入研究提供了实验依据。本试验主要包括以下三部分:1 CpG-ODN对两种菌联合诱导的实验性乳腺炎山羊乳腺的保护研究选择同处于泌乳初期的睢宁白山羊6头,体重为30～40kg。产后第5天,于右乳区经过乳导管灌注CpG-ODN(剂量10μg·kg-1体重),左乳区灌注等体积的灭菌磷酸盐缓冲液(PBS,0.01mol·L-1 pH 7.2)作为对照,灌注后第3天按同等剂量进行二次灌注,产后第9天,于左右乳区经乳导管灌注2×109CFU·mL-1金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus,S.aureus）和2×109CFU·mL-1大肠杆菌（Escherichia coli,E.coli）各1.5 mL。灌注后72 h,处死动物,取乳腺组织。临床症状及病理切片观察均显示,乳腺内灌注2×109CFU·mL-1的金黄色葡萄球菌和2×109CFU·mL-1大肠杆菌（Escherichia coli,E.coli）能成功诱导山羊典型的乳腺炎症状。与灌注PBS相比,乳腺灌注CpG-ODN能显著降低乳腺组织中部分炎症相关因子及酶的含量,肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor-α,TNF-α）的含量显著降低（P＜0.05）,白细胞介素-1β（Interleukin-1β,IL-1β）、白细胞介素-6（Interleukin-1,IL-6）含量有所降低但差异不显著（P＞0.05）;N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶（N-acetyl-β-D-glucosaminidase,NAGase）活性极显著降低（P＜0.01）,髓过氧化物酶（Myeloperoxidase,MPO）活性显著降低（P＜0.05）。实验结果表明灌注CpG-ODN可以抑制乳腺组织内IL-1β、TNF-α等炎性细胞因子及和炎症相关酶的释放、减轻炎症因子对乳腺的损伤,证实了CpG-ODN对金葡菌和大肠杆菌联合感染诱发的山羊乳腺炎的乳腺有保护作用。2 CpG-ODN对两种菌联合诱导的实验性乳腺炎山羊乳和血清中相关细胞因子与酶的影响对定时采集的乳样和血清中相关细胞因子和酶的活性进行分析。结果显示,PBS和CpG-ODN处理乳区乳中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）水平同在感染后24 h上升至最高,但感染后24 h CpG-ODN乳区较PBS侧下降10.38%（P＜0.05）。CpG-ODN能显著提高感染前乳汁白细胞介素-2（IL-2）水平。灌注CpG-ODN乳区IL-1β在感染后24 h上升至最高（P＜0.01）,而灌注PBS乳区则在感染后48 h上升至最高（P＜0.01）,在感染后24 h、48 h较PBS乳区分别下降了11.87%（P＜0.05）、28.72%（P＜0.01）。灌注CpG-ODN侧乳中NAGase、MPO活性随时间的变化表现为先上升后下降,在24h达到最大值;PBS侧乳中NAGase、MPO活性随时间变化表现出相同的规律,但NAGase峰值高于灌注CpG-ODN侧,MPO峰值低于灌注CpG-ODN侧;血清中TNF-α先上升后下降,第24 h时最大,第8 h与第0 h相比差异显著（P＜0.05）;IL-1β、IL-2均先下降后上升再下降,分别在第24 h、48 h时达最大,各时间点与第0 h相比差异均不显著;MPO活性随时间的变化先下降后上升,24 h最低,与0 h相比差异极显著（P＜0.01）;NAGase活性变化与MPO一致,到达最小值的时间为第48 h,各时间点与第0 h相比差异均不显著。结果表明CpG-ODN可通过提高乳中IL-2水平、加速并促进乳汁TNF-α、IL-1β的释放,对缩短炎症过程也有一定的作用,证实CpG-ODN对金葡菌和大肠杆菌联合感染诱发的山羊乳腺炎有一定的保护作用。3 CpG-ODN对实验性乳腺炎山羊乳中乳铁蛋白含量及乳腺组织二维凝胶电泳谱的影响用ELISA法对实验中定时采集的乳样进行乳铁蛋白含量测定。结果显示,灌注CpG-ODN乳区乳铁蛋白含量随时间的变化先上升后下降,在第16 h达到最大（P＜0.01,compared to 0 th hour）,灌注PBS的乳区乳铁蛋白含量随时间的变化也是先上升后下降,在第24 h达到最大（P＜0.01,compared to 0 th hour）。CpG-ODN可能通过影响非特异性免疫在乳腺炎发生时发挥对机体的保护作用。此外,本实验以乳腺组织为对象,初步建立乳腺蛋白质组研究的二维电泳（two-dimensional electrophoresis,2-DE）技术,通过优化各种实验参数,建立了乳腺组织蛋白质表达谱,为其后全景式的蛋白质鉴定奠定基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 中英文对照
• 引言
• 第一篇 文献综述
• 第一章 奶牛乳腺炎的研究进展
• 1 奶牛乳腺炎的病因调查
• 2 奶牛乳腺炎的分类
• 3 奶牛乳腺炎的危害
• 4 金黄色葡萄球菌和大肠杆菌乳腺炎研究进展
• 参考文献
• 第二章 乳腺防御机制研究进展
• 1 乳腺的组织结构
• 2 乳腺防御机制研究进展
• 参考文献
• 第三章 奶牛乳腺炎的诊断与防治研究进展
• 1 奶牛乳腺炎的诊断
• 2 乳腺炎的防治方法
• 参考文献
• 第四章 CpG-ODN的研究进展
• 1 CpG-ODN免疫刺激序列的发现
• 2 CpG-ODN的基本结构特点
• 3 CpG-ODN的免疫学功能
• 4 CpG-ODN的应用
• 5 问题与展望
• 参考文献
• 第二篇 试验研究
• 第一章 CpG-ODN对两种菌联合诱导的实验性乳腺炎山羊乳腺的保护研究
• 1 材料与方法
• 2 结果与分析
• 3 讨论
• 4 小结
• Abstract
• 参考文献
• 第二章 CpG-ODN对两种菌联合诱导的实验性乳腺炎山羊乳和血清中相关细胞因子与酶的影响
• 1 材料与方法
• 2 结果与分析
• 3 讨论
• 4 小结
• Abstract
• 参考文献
• 第三章 CpG-ODN对实验性乳腺炎山羊乳中乳铁蛋白含量及乳腺组织二维凝胶电泳谱的影响
• 1 材料与方法
• 2 结果与分析
• 3 讨论
• 4 小结
• 附录
• Abstract
• 参考文献
• 全文结论
• 致谢
• 硕士期间发表和完成的论文