SARS相关冠状病毒S1基因片段真核表达载体的构建及其免疫活性测定

论文摘要

目的:根据GeneBank登录的BJ01株SARS-CoV核酸序列合成801bp S1基因片段（22382bp～23182bp）,构建SARS-CoV相关冠状病毒S1基因片段真核表达载体,并肌注免疫BALB/c小鼠,观察小鼠所产生的体液免疫和细胞免疫应答水平,从而为SARS-CoV生物学活性的研究及核酸疫苗的研制提供实验依据。 方法:用PRIMER5.0引物设计软件设计引物,聚合酶链反应（PCR）扩增S1基因片段801bp。将PCR产物纯化后与pUCm-T载体连接,经蓝白斑筛选、双酶切鉴定及序列分析后,亚克隆至pcDNA3.1（+）真核表达载体中;阳性克隆经双酶切鉴定后转染HeLa细胞,免疫细胞化学法与Western-Blotting鉴定其在真核细胞中的表达;以pcDNA3.1（+）/S1肌注免疫6周龄BALB/C小鼠,PCR与免疫组化法检测SARS相关冠状病毒S1基因在小鼠股四头肌的表达,ELISA法检测抗SARS-CoV IgG,MTT法检测免疫小鼠的T细胞增殖活性,并检测免疫小鼠脾淋巴细胞的IFN-γ水平。 结果:扩增的SARS-CoVS1基因片段801bp亚克隆至pcDNA3.1（+）/S1后,免疫细胞化学试验与Western-Blotting结果表明pcDNA3.1（+）/S1可以在HeLa细胞中表达大小约为32KD的S1蛋白。免疫组织化学结果显示pcDNA3.1（+）/S1免疫组小鼠股四头肌细胞内表达了SARS-CoV S1蛋白。免疫后小鼠的体液与细胞免疫应答水平均随免疫时间增强。随着免疫次数的增加和接种时间的延续,pcDNA3.1（+）/S1免疫组小鼠体内抗SARS-CoV IgG量明显升高,抗体滴度达1∶2000。T淋巴细胞增殖实验表明,pcDNA3.1（+）/S1注射组细胞加入刺激物后,细胞成团生长,pET-22b/S1重组蛋白刺激组较PHA刺激组细胞增殖明显活跃,各组间有显著性差异（采用方差分析,F=12.045,P=0.000,P<0.05）;细胞因子IFN-γ检测

论文目录

• 主要英文缩略语索引
• 中文摘要
• 英文摘要
• 论文正文
• 1. 前言
• 2. 实验材料
• 3. 实验方法
• 4. 结果
• 5. 讨论
• 6. 结论
• 参考文献
• 附录
• 综述
• 研究成果及发表论文
• 致谢