载铜硅酸盐纳米微粒对肠上皮细胞增殖、分化和迁移的影响

论文摘要

目的:通过对鸡肠上皮细胞（IEC）的分离和原代培养建立IEC细胞系,比较酶对细胞的消化和增殖影响,促进细胞增殖的最适血清浓度,CO2浓度和温度。然后以IEC细胞系为实验模型,研究载铜硅酸盐纳米微粒（CSN）对鸡IEC形态、增殖、分化及损伤后细胞迁移的影响。 方法:1.采用不同的消化酶体外分离鸡IEC,并培养。2.IEC生长、增殖检测采用MTT法和细胞计数法。3.用倒置显微镜、透射电镜观察IEC生长状态、形态。4.IEC鉴定用碱性磷酸酶和H-E染色法。 结果:1.用300U/mL Ⅺ型胶原酶和0.1mg/mL Ⅰ型中性蛋白酶在37℃下联合消化40min,经离心可收集到大量的细胞。在倒置显微镜下观察,其粘膜悬液主要由隐窝样上皮细胞团组成,细胞呈球性或卵石状,边界清楚,胞浆丰富,核为圆形或卵石状,核内染色质稀疏空亮,核仁1～2个。2.在含2.5～5.0%胎牛血清的DMEM培养基中,39℃,5～7.5%CO2下培养,一定时间后,在透射电镜下,可观察到细胞具有典型的肠上皮隐窝细胞特征,IEC表面有大量的微绒毛,细胞贴壁短期内细胞间的紧密连接,桥粒等,细胞内含有丰富的线粒体和内质网等。IEC在1～2d贴壁,6～7d明显增殖,10～12d汇合成片,细胞呈多角形单层生长。3.本试验用碱性磷酸酶作标记物进行免疫酶染色,结果显示,分离的细胞培养至第7天时,（91.164±6.97）%细胞呈蓝黑色反应。4.与对照组相比,添加30μg/mL或50μg/mL CSN后细胞形态未发生变化,在第10天时,细胞表面的微绒毛比未加CSN的更加明显;添加CSN培养孔中细胞的增殖更加明显,该孔细胞在第10天时已完全汇合成片,而未添加孔细胞在第10天时还有未完全汇合区域;CSN可使单位面积里迁移细胞的数量显著增多（P<0.05）,能促进损伤后细胞的快速修复。 结论:1.确定了用300U/mL胶原酶Ⅺ和0.1mg/mL Ⅰ型中性蛋白酶联合消化法为较好的细胞分离方法,含2.5%～5%FCS为较适宜的血清浓度,39℃和5%～7.5%CO2为较好的培养条件。鸡IEC经显微镜和组织化学鉴定,所培养细胞主要为IEC。2.在鸡IEC原代培养中添加30μg/mL、50μg/mL CSN,能促进IEC的增殖、分化及损伤细胞的修复。

论文目录

• 主要缩写词
• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一章 引言
• 1 微量元素铜在动物机体内的代谢与生物学功能
• 1.1 概述
• 1.2 对铜的摄入与排出
• 1.3 铜的促生长作用机理
• 1.4 铜的组织残留、毒性与应用
• 2 纳米科技在畜牧业中的应用前景
• 2.1 纳米材料在饲料业中的应用
• 2.2 纳米在药物中的应用
• 2.3 纳米技术在动物遗传育种中的应用
• 2.4 纳米技术环境保护中的应用
• 3 小肠粘膜上皮细胞的体外培养现状及其影响因素
• 3.1 小肠粘膜上皮细胞原代培养的研究进展
• 3.2 分离肠粘膜上皮细胞的影响因素探讨
• 3.3 动物细胞贴壁生长机理
• 3.4 影响小肠粘膜上皮细胞生长和分化的因素
• 第二章 鸡肠上皮细胞分离及原代培养方法研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料、试剂、器械
• 1.2 主要培养用液
• 1.3 试验方法
• 1.4 台盼蓝染色法计算活细胞百分数
• 1.5 小肠上皮细胞的形态学检查
• 1.6 MTT法测定细胞的生长和增殖情况，并绘制细胞生长曲线
• 1.7 免疫细胞化学定性检测小肠上皮细胞:采用碱性磷酸酶活性显色
• 1.8 数据处理
• 2 试验结果
• 2.1 IEC分离
• 2.2 IEC形态特征
• 2.3 IEC贴壁及生长
• 2.4 台盼蓝染色鉴定
• 2.5 细胞的生长与增殖
• 2.6 消化酶的选择
• 2.7 FCS对细胞增殖的影响
• 2浓度对鸡原代IEC的影响'>2.8 培养温度、CO₂浓度对鸡原代IEC的影响
• 2.9 碱性磷酸酶显示
• 3. 讨论
• 3.1 材料来源
• 3.2 消化酶的选择
• 3.3 生长基质
• 3.4 血清的浓度与质量
• 3.5 小肠上皮细胞的纯度
• 3.6 种植条件
• 3.7 细胞鉴定
• 4 小结
• 第三章 CSN对鸡肠上皮细胞增殖、分化和损伤后迁移的影响
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 细胞培养
• 1.3 小肠上皮细胞的形态学检查
• 1.4 MTT测定细胞的活力
• 1.5 免疫细胞化学定性检测小肠上皮细胞:采用碱性磷酸酶活性显色
• 1.6 细胞损伤与修复
• 1.7 数据处理
• 2 结果
• 2.1 IEC形态特征
• 2.2 细胞的生长与增殖
• 2.3 碱性磷酸酶显示
• 2.4 细胞修复
• 3 讨论
• 4 小结
• 小结及创新点
• 1 小结
• 2 创新点
• 参考文献
• 攻硕期间已发表的与硕士相关的论文
• 致谢